光学科普
商业荧光显微镜的光源通常选用卤素灯或具有宽带光的氙弧灯。其中宽带光一般用于常规目视观察和荧光激发。考虑到光激发的效率,在激发过程中,一般仅使用部分在特定光谱中可被染料(荧光模块)吸收的发射光,大部分来自光源的光会被不同类型的滤光片阻挡。
不过,由于制造缺陷,实际操作中,这些滤光片可能并不能理想地阻挡所有不需要的光,这样就会造成漏光,漏光会产生噪点并降低图像质量,这也是很多显微镜图像质量不高的原因。
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图1、显微镜照明传统光源光谱
此外,因为大多数光能位于吸收光谱区域之外,滤光片还会浪费灯的大部分能量,这意味着在荧光模式下操作显微镜时,我们需要更强大的光源,否则视图中的图像场将变得更暗和模糊。如果发射的光谱可以适合能量吸收染料范围,我们可以有更明亮的视野和更强的信号。所以,一个具有出色发光效率的光源对显微镜非常重要。
在过去的十年中,发光二极管 (LED) 技术发展迅速,光效突破了100Lm/W大关。高光效使 LED 能够在许多应用中取代传统灯。此外,LED 还具有出色的色彩表现、更长的使用寿命等其他优点。经研究实验显示,使用单色 LED 是激发荧光分子的一个很好的解决方案,我们可以选择对应光谱的LED光源作用于各种工作荧光分子。
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图2、LED光谱
研究人员 Herman 提出了一种使用 LED 作为光源的频域荧光显微镜。Hohman 将这种新的 LED 技术整合到 Colibri 照明系统中。Bormuth 在荧光显微镜中应用了不同颜色的 LED,可有效抑制 2视频增强DIC的外围光。Hanscheid采用低成本和长寿命 LED 取代荧光显微镜中更昂贵的汞灯以检测结核病 。Albeanu 介绍了使用简单的光管来耦合从 LED 光源发射到荧光显微镜的光。马丁等人和格哈特等人分别在 2009 年和 2011 年使用 LED 光源检测单个分子。
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图3、LED 结合 科勒照明光路示意图
此外,大功率应用中的 LED 采用阵列设计形式来增强图像的照明。然而,无论是单个 LED 还是 LED 阵列设计都面临一个关键问题,即来自 LED 的光具有大发散角和宽发光表面积。因此,具有出色光能聚集能力的 LED 照明系统是荧光显微镜所必需的,可以为样品提供更亮的照明和较低的电功耗。在传统光源时代,科勒照明方式具有较好的优势,因此可以考虑LED采用科勒照明。
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图4、利用TIR透镜对样本的照明示意图
考虑到LED区别传统光源的特点,工程师们还针对LED研发了专门的全反射(TIR)透镜,上图是利用TIR透镜做的针对样本的照明。总之,随着LED技术的发展,它在显微镜领域的应用价值将越来越大。