【文献解读】STORM成像揭示四膜虫睫状体基部过渡带成分和IFT颗粒的空间排列​（提供细胞试拍）

文献解读

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摘要

纤毛的基部由过渡区 (TZ) 和过渡纤维 (TF) 组成，可以作为选择门来调节鞭毛内 (IFT) 的蛋白质的运输。在进入纤毛腔之前，IFT 复合物和运输的物质在纤毛基部或附近积聚。纤毛基部 IFT 蛋白的空间组织是了解纤毛形成和功能的关键。使用随机光学重建显微镜 (STORM) 和计算平均，作者发现 7 个 TZ、9 个 IFT、3 个 Bardet-Biedl 综合征 (BBS) 和一个中心体蛋白在纤毛四膜虫的纤毛基部形成 9 个簇状环。在轴向维度上，所研究的 TZ 蛋白定位于约 30 nm 的狭窄区域，而 IFT 蛋白停靠在 TZ 附近约 80 nm 处。此外，IFT-A 亚群位于 IFT-B 亚群的外围，所研究的 BBS 蛋白位于睫状膜附近。选定蛋白质的 HA 标记的 N 和 C 末端的定位能够预测蛋白质颗粒的空间方向和可能的物质相互作用位点。基于获得的数据，作者建立了一个全面的 3D 模型，显示了所研究的睫状蛋白的排列。

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研究介绍（节选）

纤毛是基于微管的指状细胞突起。纤毛从基底体中出现，这些基底体是将纤毛锚定并定位在细胞表面内的中心同源结构。过渡区 (TZ)具有独特的超微结构和蛋白质组成。TZ的特征是Y形连接，即将轴突的微管双峰连接到睫状膜的Y形结构。TZ的生化和遗传分析揭示了TZ蛋白之间的相互作用关系。

最近出现的几种超分辨率成像工具，适用于探查蛋白质排列和分布的细微差异，能够对一些 TZ 、IFT和TF蛋白质进行详细分析。但是，目前尚不清楚 IFT 和 BBS 蛋白在进入纤毛之前究竟在哪里形成颗粒并停靠。这个问题的答案对探究 IFT/BBS 如何在纤毛基部进行调节以控制纤毛的形成和功能，以及它如何受到疾病相关而产生突变至关重要。

在这里，作者研究了纤毛虫嗜热四膜虫纤毛基部的 TZ、IFT 和 BBS 蛋白的空间组织。在横向（侧面）和顶部视图中可以看到，这种单细胞真核生物拥有数百个纤毛。单个细胞内大量的相同结构有助于提高超分辨率图像的定位精度并实现多维重建。使用随机光学重建显微镜 (STORM) 和计算平均，作者估计了 30 多个表位标签的径向和轴向位置，这些表位标签与睫状体 TZ 的七个成分、IFT 粒子的九个成分、BBSome 的三个成分和一个直系同源物融合在一起。总之，作者生成了一个全面的 3D 模型，分辨率为 15-30 nm，显示了几个 TZ、IFT 和 BBS 蛋白质在这种情况下导致的 IFT 复合体的结构变化和纤毛运输的损伤。

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研究结果（节选）

1、四膜虫TZ 蛋白的空间组织

TZ 蛋白在进化中非常保守。因此，在简单的模式生物（如纤毛四膜虫嗜热菌）中进行的分析有助于理解纤毛蛋白的定位和功能。为此，作者使用 STORM 显微镜来揭示选定四膜虫的定位TZ 蛋白并将它们在 TZ 区域内的空间组织与哺乳动物运动纤毛和初级纤毛中描述的 TZ 蛋白的排列进行比较。

图1、 过渡区蛋白的定位。

当使用 STORM 对HA 标记的 TZ 蛋白成像时，它们主要表现为 9 簇环（图 1 B，B'，C-H）。这些环的半径对应于抗原（与蛋白质融合的标签）和纤毛中心之间的距离（图 2 A''）。基于分析表位的间接与直接检测的测量值相差 1-11 nm（图 1 M）。这与 12 nm的抗体大小一致并提供了一种评估抗体标记引入的连锁错误的大小和方向的方法

 STORM 成像显示，四膜虫TMEM216 在所有研究的 TZ 蛋白中形成最大的环，半径为 164 ± 5 nm（图 1 C，M）。四膜虫的 30 个氨基酸 C 末端TMEM231 位于半径 149 ± 6 nm 处，距 TMEM216-C 末端约 15 nm（图 1 F，M）。

2、STORM 成像显示 IFT 颗粒停靠在睫状体基部

在前往纤毛之前，IFT 蛋白集中在纤毛的基部。为了在进入纤毛之前可视化 IFT 颗粒并估计它们的对接位点，作者设计了表达 N 或 C 末端 3HA 标记的 IFT 蛋白的四膜虫细胞。此外，作者分析了 ODA16、IFT 物质衔接蛋白和 KIN1、KIF3a 的四膜虫直系同源物。

图2、IFT颗粒蛋白的定位，N-或C-末端3HA标记的IFT蛋白、KIN1/KIF3A驱动蛋白和衔接蛋白ODA16的顶视图和侧（侧）视图的STORM图像。

共聚焦成像显示，在全长纤毛中，IFT 蛋白主要在纤毛基部/基体和纤毛尖端被检测到，而IFT52、IFT57、IFT80、IFT122 和IFT172 沿着纤毛长度的 IFT 信号是无法检测到的，这可能是由于全长纤毛中 IFT 粒子的浓度非常低。而STORM 成像显示，表达 IFT 融合蛋白的细胞在纤毛基部，IFT 亚基位于九个不同的位点，作者将其称为“对接位点”（图 2 A-G）。这些观察表明，在它们进入纤毛干之前，IFT 蛋白以高亲和力停靠在纤毛基部的 9 个位点。

3、BBS 蛋白定位于纤毛基部的纤毛膜附近

纤毛跨膜蛋白的转运依赖于 BBSome，这是一种与 IFT 转运密切相关的复合物。IFT27是 IFT-B 子复合体的一个组成部分，用作锚定点，BBSome 在其上连接到IFT粒子。为了阐明纤毛基部 IFT 和 BBS 复合物之间的空间关系，作者将表达 BBSome 核心蛋白的四膜虫细胞设计为与 BBS1 和 BBS5 的 N 端或 BBS9 的 N 端和 C 端连接的 3HA 标签的融合体。

图3、BBSome、OFD1 和选定的携带导致人类纤毛病的突变的 TZ 和 IFT 蛋白的定位。

STORM 成像显示，这些表位在径向和轴向上位于 IFT 复合物 A 蛋白附近，位于 IFT 颗粒的外表面（图 3 D-I），这与它们在与跨膜蛋白相互作用中的作用一致。作者还发现纤毛基部的 BBS 蛋白模式不像 IFT 蛋白那样规则，更难以可视化。据推测，这是由于 BBSome 与 IFT 粒子的结合不太稳定，或者是因为 BBSome 的丰度低于 IFT 粒子的丰度，如先前的定量蛋白质组学研究所示。

（更多研究解读将于后续分享）

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参考文献：

Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak, E. et al. STORM imaging reveals the spatial arrangement of transition zone components and IFT particles at the ciliary base in Tetrahymena. Sci Rep 11, 7899 (2021).