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摘要
随着技术的进步，远场荧光显微技术在图像分辨率中取得了重大进展，在两个横向维度上实现了20- 30nm的近分子分辨率。然而，三维(3D)纳米分辨率成像仍然是一个挑战。在这里，作者通过使用光学散光以纳米精度确定单个荧光团的轴向和横向位置来演示3D随机光学重构显微镜 (STORM)。光可切换探针的迭代、随机激活可实现每个探针的高精度3D定位，因此无需扫描样本即可构建3D图像。使用这种方法，作者在横向尺寸上实现了20-30 nm的图像分辨率，在轴向尺寸上实现了 50-60 nm的图像分辨率。这一发展使我们能够分辨纳米级细胞结构的 3D 形态。
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研究介绍（节选）
由于其非侵入性和多色能力，远场光学显微镜在结合荧光标记时可提供具有最小扰动和生物分子特异性的生物样本的三维 (3D) 成像。这些优点使荧光显微镜成为生物学中使用最广泛的成像方法之一。然而，衍射屏障将传统光学显微镜的成像分辨率限制在横向维度上的 200-300 nm，使许多细胞内细胞器和分子结构无法分辨。最近，衍射极限已被超越，20 - 50 nm 的横向成像分辨率已通过几种“超分辨率”远场显微镜技术实现，包括受激发射耗尽 (STED) 及其相关的 RESOLFT 显微镜、饱和结构照明显微镜 (SSIM)、STORM、光激活定位显微镜 (PALM)和其他使用类似原理的方法。
虽然这些技术提高了 2D 图像分辨率，但解析大多数细胞器和细胞结构需要在三个维度上进行高分辨率成像。三维荧光成像最常使用共焦或多光子显微镜进行，其轴向分辨率通常在 500-800 nm 的范围内，比横向分辨率差两到三倍。轴向成像分辨率可以通过 4Pi 和 I5M 显微镜提高到大约 100 nm 。此外，通过使用 4Pi 照明几何沿轴向方向采用STED成像可以使轴向分辨率高达 30 - 50 nm，但相同的方案在横向分辨率中并不能实现。
在这里，作者向我们展示了 3D STORM 成像，其空间分辨率比所有三个维度的衍射极限好10倍，且无需调试样品或光束扫描。STORM 和 PALM 依赖于单分子检测，并利用某些荧光团的光可切换特性在时间上分离大量分子的其他空间重叠图像，从而实现单个分子的高精度定位。除了检测到的光子数量受到限制，单个荧光染料的横向尺寸可以实现高达 1 nm 的定位精度。在这项工作中，作者使用散光成像方法来实现 3D STORM 成像。在 3D STORM 分析中，然后通过将其图像的测量 wx 和 wy 值与校准曲线进行比较来确定每个光激活荧光团的 z 坐标。此外，对于浸入玻璃基板上的水溶液中的样品，所有 z 定位都重新调整了 0.79 倍，以说明玻璃和水之间的折射率不匹配。
图 1、3D STORM 方案。(A) 单个荧光团的三维定位。(B) 作为从单个 Alexa 647 分子获得的 z 函数的图像宽度 wx 和 wy 的校准曲线。(C) 单分子的三维定位分布。
STORM 的 3D 分辨率受限于单个光激活荧光团在切换周期期间在三个维度上定位的精度。在这里，作者使用 Cy3 和 Alexa 647 作为激活剂和报告基因对来执行 3D STORM 成像。红色激光 (657 nm) 用于对 Alexa 647 分子进行成像并将其停用至黑暗状态，而绿色激光 (532 nm) 用于重新激活荧光团。在发生永久性光漂白之前，每个激活子-报告子对可以循环打开和关闭数百次，使用物镜型全内反射荧光 (TIRF) 或落射荧光成像几何，在每个开关循环平均可以检测到 6000 个光子。这种可逆的开关行为提供了一种内部控制来测量定位准确性。
作为 3D STORM 的初始测试，作者将 200 nm 生物素化聚苯乙烯微球固定在玻璃表面上制备的模型样品进行成像，然后将样品与 Cy3-Alexa 647 标记的链霉抗生物素蛋白一起孵育，再用光切换探针涂覆微球。通过迭代、随机激活光学可分辨 Alexa 647 分子的稀疏子集，获得珠子的 3D STORM 图像，从而确定单个分子的 x、y 和 z 坐标。在多个激活周期的过程中，许多荧光团的位置被确定并用于构建完整的 3D 图像。当沿三个方向观察时，微球图像的投影近似球形，由于每个荧光团的图像同时编码其 x、y 和 z 坐标，与 2D STORM 成像相比，在 3D STORM 中定位每个分子所花的时间更短。
关于3D STORM应用于细胞成像，作者对绿猴肾上皮 (BS-C-1) 细胞中的微管网络进行了间接免疫荧光成像。用一抗对细胞进行免疫染色，然后用 Cy3 和 Alexa 647 双标记二抗。与传统的宽视场荧光图像（图 2A、B）相比，3D STORM 图像不仅显示出分辨率的显著提高，而且还提供了 z轴信息（图 2B 中的颜色编码）。从图 2C-E中清晰可见在细胞的 x-y、x-z 和 y-z 横截面中分布的多层微管丝。为了更定量地描述细胞成像分辨率，作者确定了细胞中的点状物体，这些物体表现为远离任何可辨别的微管细丝的小簇定位，而这些簇可能代表非特异性附着在细胞上的单个抗体。
图 2、细胞中微管的三维 STORM 成像。(A) BS-C-1 细胞大面积微管的常规间接免疫荧光图像。(B) 同一区域的 3D STORM 图像，z 位置信息根据彩色刻度条进行颜色编码。(C-E) (B) 中白框勾勒出的细胞小区域的 x-y、x-z 和 y-z 横截面，显示 5 个微管细丝。(F) 两个微管的 z 剖面在 x-y 投影中交叉，但在 z 中相隔 102 nm，与 (B) 中箭头指示的区域分开。
最后，为了证明 3D STORM 可以用于解析细胞中纳米级结构的 3D 形态，作者对 BS-C-1 细胞中的网格蛋白涂层凹坑 (CCP) 进行了成像。CCP 是球形笼状结构，大小约为150-200 nm，由网格蛋白和细胞膜细胞质侧的辅助因子组装而成，以促进内吞作用。为了对 CCP 进行成像，作者采用了直接免疫荧光方案，使用的是针对网格蛋白Cy3 和 Alexa 647 双重标记的一抗。当通过常规荧光显微镜成像时，所有 CCP 都显示为几乎衍射极限的斑点，没有可辨别的结构（图 3A）。在丢弃z维信息的 2D STORM 图像中，可以清楚地看到 CCP的圆形（图 3B、D）。从 180 ± 40 nm 的 2D 投影图像测量的 CCP 的尺寸分布在数量上与使用电子显微镜确定的尺寸分布一致 (32)。包括 z 维度的信息使我们能够清楚地看到凹坑的 3D 结构（图 3C，E - H）。图 3C 和 3E 显示了图像的 x-y 横截面，取自细胞表面凹坑开口附近的区域。凹坑外围的圆形环状结构显示出较高的分辨率。凹坑的连续 x-y 和 x-z 横截面（图 3F-H）清楚地揭示了这些纳米级结构的三维半球笼状形态，这在 2D STORM 图像中是无法观察到的。总之，作者通过 STORM 显微镜展示了具有 20-30 nm 横向分辨率和 50-60 nm 轴向分辨率的 3D 超分辨率成像。这种成像能力允许在环境条件下以光学方式解析细胞结构的纳米级特征，其分辨率以前只能用电子显微镜才能看到。
图 3. 细胞中网格蛋白包被的凹坑的 3D STORM 成像。(A) BS-C-1 细胞区域中网格蛋白的常规直接免疫荧光图像。(B) 同一区域的 2D STORM 图像，包括不同 z 位置的所有定位。(C) 同一区域的 x-y 横截面 (z 中厚 50 nm), 显示质膜处 CCP 外围的环状结构。(D, E) 2D STORM (D) 中两个附近 CCP 的放大图及其 3D 图像 (E) 中 100 nm 厚的 x-y 横截面。(F - H) CCP 的串行 x-y 横截面（z 方向每个 50 nm 厚）（F）和 x-z 横截面（y 方向每个 50 nm 厚）（G），以及 x-y 和 x-z 横截面3D 透视图 (H)，显示坑的笼状结构。
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超高分辨率显微成像系统
iSTORM
宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM，采用了源自诺贝尔化学奖原理的 STORM 超高分辨率显微成像技术, 实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在 20 nm的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及超分子结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实，从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。
图4、力显智能自主研发的超高分辨率显微成像系统iSTORM
超高分辨率显微成像系统 iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同时成像、3D同步拍摄、实时重构、2小时新手掌握等特点，已实现活细胞单分子定位与计数，并提供荧光染料选择、样本制备、成像服务与实验方案整体解决方案，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。
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参考文献：
Huang B, Wang W, Bates M, Zhuang X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 2008 Feb 8;319(5864):810-3. doi: 10.1126/science.1153529. Epub 2008 Jan 3. PMID: 18174397; PMCID: PMC2633023.
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