“ 数字图像处理是通过图像数据进行相关功能处理和分析的技术。在STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)系统中,生物样本信息经由光路放大后,投射到系统的主相机感光板上,转化为数字图像数据,由数字图像处理系统统一进行处理。本文就STORM的数字图像处理系统给大家做个介绍。”
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成像原理
由于光学衍射极限的存在,对于200nm以下的显微样品结构,就无法利用光学放大的方式去进行观测,举个例子,图1(a)和图1(b)是两个在数字图像中坐标位置不同的光斑,将两个光斑进行叠加,获得图1(c)的重合光斑。由此可知,图1(c)是由图1(a)和图1(b)两个结构结合而成的,但由于衍射极限的存在,我们无法将图1(c)进行放大,从而获得前者的两个结构特征,这就是STORM系统要解决的实际问题:如何获得200nm衍射极限下的样本结构信息。
“无论一个样品结构有多复杂,总是能够描述为是由一个个点构成的。”这就是STORM的核心原理,如图2所示,假设图1中的两个光斑结构在不同时间分别进行闪烁,对闪烁的每一帧图像数据中的高斯光斑进行捕捉和拟合,获得高斯光斑的中心位置并记录,在完成拍摄后,将所有记录下的光斑信息进行叠加重构,便可获得完整的结构信息。
在STORM系统中,通过生物试剂以及光学激发,利用计算机处理相机拍摄到的随机荧光闪烁,并对闪烁的光斑进行统一分析,就可获得生物样本200nm以下的结构信息。
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误差校正
图4.图像中存在的串色
STORM系统目前支持3通道同时成像,在硬件结构上,光路结构的差异和色差造成各个通道之间存在一定的误差。如图5所示,红通道(561nm激光)与绿通道(647nm激光)在拍摄金纳米粒子时产生的图像分离。
图5.通道的偏移
经实验发现,由于光路传递的原因,会造成每个通道会产生不同的程度的畸变与距离偏差,为了抵消这些系统误差,数字图像系统利用金纳米粒子对系统误差进行修正,在拍摄好金纳米粒子的宽场图像后,对每个荧光点在x与y方向进行通道误差计算,获得每个金纳米点与对应通道上的最近邻匹配点的误差数据,通过对齐算法,最终确定当前通道与对应通道之间的误差关系。
STORM不仅可以拍摄生物样本的二维信息,还可以对生物样本的三维信息进行分析与重构,这时就需要对三维方向上的误差进行校准,以便展示给用户的是最准确的信息。
三维信息获取的一种方式是依靠系统光路中的柱面镜对成像造成的影响,如图6所示,在加入柱面镜后,当发光点位于焦平面下方时,捕获到的光斑为竖直方向拉伸,同理,当发光点位于焦平面上方时,捕获到的光斑为横方向拉伸。利用这个特性,通过对光斑形态的分析,便可获得每个光斑在超高亚像素上的长宽边界差值与深度信息的曲线关系,从而反向推导出该发光点的实际深度信息。
图6.柱面镜对光斑的影响
在获得每个闪烁光斑的深度信息后,STORM便可对拍摄样本进行3D重构,获得如下效果:
图7.重构后的肌动蛋白长丝的 x-y 和 x-z 横截面
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讨论
超分辨率显微作为一类很新的技术,突破了光学成像中的衍射极限,把传统成像分辨率提高了10~20倍,成为研究细胞结构的利器。过去七八年间,这些技术不断推进,先后实现了多色、三维和活细胞高速成像,这些技术的发展都离不开数字图像处理技术的功劳。科技的进步,有赖于站在巨人的肩膀上,将各个不同领域的技术和智慧有机结合,这便是STORM的魅力所在。
宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)致力于最前沿的超高分辨率显微技术研究和产品开发,拥有包括PALM在内的多种超高分辨率技术的技术储备,可满足客户定制化需求。现已成功实现商业化的iSTORM超分辨率显微系统,采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等,以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性,获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。
参考文献:
1. 张世超, 李思黾, 杨光,等. 3D-STORM超分辨成像中单分子轴向定位精度优化研究[J]. 光子学报, 2015(10):6.
2. Rust M J . Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).[J]. Nature Methods, 2010, 3.
3.Yu, Lujia. Three color super-resolution localization microscopy for optical mapping of stretched DNAs in nanochannels.Thesis (M.Phil.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2019
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