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  误差校正  

1、串色

串扰问题可以定义为荧光从一个通道到其他通道的泄漏，串扰的原因是因为多种荧光染料的发射光谱重叠。然而，二向色镜无法完全阻挡重叠光谱，这就导致当前通道上会出现不属于该通道的图像信息。

图4.图像中存在的串色

STORM系统目前支持3通道同时成像，在硬件结构上，光路结构的差异和色差造成各个通道之间存在一定的误差。如图5所示，红通道(561nm激光)与绿通道（647nm激光）在拍摄金纳米粒子时产生的图像分离。

图5.通道的偏移

经实验发现，由于光路传递的原因，会造成每个通道会产生不同的程度的畸变与距离偏差，为了抵消这些系统误差，数字图像系统利用金纳米粒子对系统误差进行修正，在拍摄好金纳米粒子的宽场图像后，对每个荧光点在x与y方向进行通道误差计算，获得每个金纳米点与对应通道上的最近邻匹配点的误差数据，通过对齐算法，最终确定当前通道与对应通道之间的误差关系。

3、3D校准

STORM不仅可以拍摄生物样本的二维信息，还可以对生物样本的三维信息进行分析与重构，这时就需要对三维方向上的误差进行校准，以便展示给用户的是最准确的信息。

三维信息获取的一种方式是依靠系统光路中的柱面镜对成像造成的影响，如图6所示，在加入柱面镜后，当发光点位于焦平面下方时，捕获到的光斑为竖直方向拉伸，同理，当发光点位于焦平面上方时，捕获到的光斑为横方向拉伸。利用这个特性，通过对光斑形态的分析，便可获得每个光斑在超高亚像素上的长宽边界差值与深度信息的曲线关系，从而反向推导出该发光点的实际深度信息。

图6.柱面镜对光斑的影响

在获得每个闪烁光斑的深度信息后，STORM便可对拍摄样本进行3D重构，获得如下效果：

图7.重构后的肌动蛋白长丝的 x-y 和 x-z 横截面

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讨论

超分辨率显微作为一类很新的技术，突破了光学成像中的衍射极限，把传统成像分辨率提高了10～20倍，成为研究细胞结构的利器。过去七八年间，这些技术不断推进，先后实现了多色、三维和活细胞高速成像，这些技术的发展都离不开数字图像处理技术的功劳。科技的进步，有赖于站在巨人的肩膀上，将各个不同领域的技术和智慧有机结合，这便是STORM的魅力所在。

宁波力显智能科技有限公司（INVIEW）致力于最前沿的超高分辨率显微技术研究和产品开发，拥有包括PALM在内的多种超高分辨率技术的技术储备，可满足客户定制化需求。现已成功实现商业化的iSTORM超分辨率显微系统，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。