cDNA第一链合成试剂盒(逆转录试剂盒、RT试剂盒)
产品及特点 本试剂盒提供合成 cDNA 第一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MuLV RT)高效合成 mRNA 的全长 cDNA 拷贝。
1. 使用突变的反转录酶,内源 RNase H 活性低。
2. 最长可合成 13 Kb 的 cDNA。
3. 可以使用 oligo-dT、随机引物和 RNA 专一性引物三种引物(前两种本试剂盒提供)。
4. 总 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作为模板。
5. 可用于 cDNA 文库构建、RT-PCR、探针标记等。
规格及成分
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/97c13c3e-450e-4d9f-9945-4664bc72be58.jpg)
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/d24dea8a-42da-4032-9460-1b170f803bc0.jpg)
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法 一:合成 PCR 用的 1st-strand cDNA
1. 按下表配制 RT 反应体系:
![image 2022061710181906899](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/f6a4ec38-e00c-49ba-a546-ba9d73e06494.jpg)
引物
![image 2022061710183548914](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/a08a8d66-5c7e-4c7d-a423-8b5a44bedd0d.jpg)
2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。
3. 再加入 5 uL RT Buffer(含 dNTP)。
4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板,可以改成 45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物,则改成 25℃ 5 分钟。
5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶(含 RI),反应终体积为 20 uL。
6. 42℃保温 60 分钟(但如果使用随机引物,需要先 25℃保温 10 分钟,然后再转移到 42℃保温 60 分钟)。此步为 RT 反应。
7. 70℃保温 10 分钟以终止反应,然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用,不需要纯化。
二:合成建文库用的 1st-strand cDNA
1. 按下表配制 RT 反应体系:
![image 2022061710185357091](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/37edbedd-25be-4628-a648-4bd5e98603cb.jpg)
2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。
3. 再加入 5 uL RT Buffer(含 dNTP)。
4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板,可以改成 45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物,则改成 25℃ 5 分钟)。
5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶(含 RI),反应终体积为 20uL。
6. 42℃保温 60 分钟(但如果使用随机引物,需要先 25℃保温 10 分钟,然后再转移到 42℃保温 60 分钟)。此步为 RT 反应。
7. 70℃保温 10 分钟以终止反应,放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。
三:用对照模板合成 cDNA(需要用同位素,需要对照的客户需要单独跟基因联系)
1. 按下表配制 RT 反应体系:
![image 2022061710190779629](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/dc72ce44-08a4-478a-998b-de968291b328.jpg)
2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。
3. 再加入 5 uL RT Buffer(含标记 dNTP,本试剂不提供)。
4. 37℃保温 5 分钟。如果使用随机引物,则保温温度只能是 25℃。
5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶(含 RI),反应终体积为 20uL。
6. 42℃保温 60 分钟(但如果使用随机引物,需要先 25℃保温 10 分钟,然后再转移到 42℃保温 60 分钟)。
7. 加 1uL 0.5M EDTA,放置在冰上待用。
8. 电泳检测。合成的 cDNA 的量一般有加入 RNA 总量的 50%以上,电泳一般能出现 1.1Kb 的片段(如果使用随机引物,将出现多个小片段)。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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