肌酐(Cr)含量检测试剂盒说明书(肌氨酸氧化酶法)
可见分光光度法
规格:50T/48S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/5dc532cb-2802-4199-b514-b3ec166520b2.jpg)
溶液的配制:
1. 试剂一:临用前每支加入 1.7 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
2. 试剂二:临用前每支加入 1.65 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
3. 试剂三:临用前每支加入 1 mL 蒸馏水(50T/48S),充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
4. 试剂三工作液:根据试验所需用量,按照试剂三:蒸馏水=1:9 的比例,充分混匀,现配现用。
5. 试剂四:临用前加入 1 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两个月。
6. 试剂五:临用前每瓶加入 3.4 mL 蒸馏水,充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。
7. 试剂六:临用前根据实验所需用量,按照试剂六 A 液:试剂六 B 液=1:1 的比例,充分混匀,现用现配。
8. 标准品:1 mg 肌酐。临用前加入 1 mL 蒸馏水,充分溶解,即 1 mg/mL 标准储备液,4℃保存 1 个月。临用前取 50μL 和 200μL 蒸馏水混合配制成 200μg/mL 的标准溶液备用,现用现配。
产品说明:
肌酐(creatinine,Cr),化学式是 C4H7N3O,是肌肉在人体内代谢的产物,主要由肾小球滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种,外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物;内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。
肌酐在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素,肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化产生过氧化氢。过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在 505nm 有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞样本的制备:按照细胞数量(104个):提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500万细胞加入1mL提取液一),冰浴超声波破碎细胞(功率300W,超声3秒,间隔9秒,总时间5 min);于4℃,12000g离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,混匀,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
2、组织样本的制备:按照质量(g):提取液一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于 4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,混匀,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
3、血清(浆):取 100 μL 血清(浆)加入 1 mL 提取液一,4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,混匀,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 505 nm,蒸馏水调零。
2、 按下表步骤加样:
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/575e536d-808d-4468-ba7b-ba9d4a21661f.jpg)
注:空白管只需做 1-2 次。
三、肌酐含量计算
1、 计算公式
(1)按照蛋白浓度计算
肌酐含量(μg/mg prot)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×V 样÷(V 样×Cpr)=200×ΔA 测÷ΔA 标÷Cpr
(2)按照样本质量计算
肌酐含量(μg/g 质量)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷(W×V 上清÷V 提取液一)
= 237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷W
(3)按照细菌或细胞数量计算
肌酐含量(μg/104cell)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷(细胞数量×V 上清÷V 提取液一)
= 237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷细胞数量
(4)按照血清(浆)体积计算
肌酐含量(μg/mL)= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]
= 2612.5×ΔA 测÷ΔA 标
C 标:标准管浓度,200 μg/mL;V 样:加入样本体积,60 μL=0.06 mL;V 上清:提取时上清液体积,0.8mL;V 提取液一:加入提取液一体积,1 mL;V 提取液二:加入提取液二体积,0.15 mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;细胞数量:以 104计;V 液体:液体样本体积,0.1 mL。
注意事项:
1、提取液中含有蛋白沉淀剂,提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取样本,即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞,用 1.1875mLPBS(生理盐水)匀浆;取相同体积的血清(浆),用 1.206mLPBS(生理盐水)匀浆(相当于提取步骤最终样本上清液),用 BCA 法进行蛋白浓度测定。
2、如果测定吸光值超过标准管吸光值,建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果 ΔA 测定小于 0.01,建议增大样本量后再进行测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肌肉加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心,取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二,离心取上清后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测=A 测定-A 空白=0.159-0.016=0.143,ΔA 标=A 标准-A 空白=0.373-0.016=0.357。按样本质量计算含量得:
肌酐含量(μg/g 质量)=237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷W=951.3 μg/g 质量。
2、 取 100μL 牛血清加入 1mL 提取液一,取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二,离心取上清,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测=A 测定-A 空白=0.095-0.079=0.079,ΔA 标= A 标准-A 空白=0.373-0.016=0.357。按照液体体积计算含量得:
肌酐含量(μg/mL)= 2612.5×ΔA 测÷ΔA 标=578 μg/mL 血清。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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