α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/c1e10ab2-e2db-425a-94cd-de9ee9c8721e.jpg)
溶液的配制:
1、试剂一:临用前取 1 瓶加入 2.667mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂建议分装后-20℃保存一周,避免反复冻融。
2、标准品:5 μmol/mL 的对-硝基苯酚。
产品说明:
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase,α-L-Af)属于糖基水解酶家族,可以从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个 L-阿拉伯糖分子。该酶在半纤维素降解以及果实的成熟软化过程中有着重要作用。
α-L-Af 分解对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚,对-硝基苯酚在 400 nm 处有最 大吸收峰,通过测定 400 nm 处吸光值变化可计算得 α-L-Af 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 15000 g,4℃,离心 10 min,取上清(若为绿色植物的茎、叶、芽等组织,建议将上清用提取液稀释 5 倍后检测;若为果肉等组织,上清可直接检测或根据预测定结果稀释相应倍数后检测)置于冰上待测。
2、细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000︰1 的比例(建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 200 W,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 15000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。
3、液体:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 400 nm,蒸馏水调零。
2、 将 5 μmol/mL 的对-硝基苯酚标准液用提取液稀释为 250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 nmol/mL 的标准溶液备用。
3、 操作表:(在 1.5 mL 离心管中)
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/c016a804-ac5b-475f-9ef3-31265c5f18e4.jpg)
三、α-L-Af 活性计算
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(nmol/mL)。
2、 α-L-Af 活性的计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 蛋白每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-L-Af 酶活(U/mg prot)= x×V 提取÷(V 提取×Cpr)÷T=2x÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:每 g 样本每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-L-Af 酶活(U/g 质量)= x×V 提取÷W÷T= 2x÷W
(3)按照细胞或细菌数量计算
酶活定义:每 104 个细胞每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-L-Af 酶活(U/104 cell)= x×V 提取÷细胞数量(万个)÷T= 2x÷细胞数量(万个)
(4)按液体体积计算
酶活定义:每 mL 样本每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。
α-L-Af 酶活(U/mL)=x×V 样÷V 样÷T=2x
V 提取:提取液体积,1 mL;V 样:加入的样本体积,0.3 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,0.5 h。
注意事项:
1、 A 或 ΔA 大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
2、 正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定,若浓度过高,建议将样本用提取液稀释适当倍数后再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数;若浓度过低,建议在粗酶液提取时增加组织质量。
3、 加入试剂二后,建议 5 min 内读取 OD 值。
实验实例:
1、 取 0.1g 香蕉进行样本处理,取上清后,按测定步骤操作,测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.234-0.105=0.129,带入标准曲线 y=0.0037x+0.0029,计算 x=34.08,按样本质量计算酶活得:
α-L-Af 酶活(U/g 质量)=2x÷W=2×34.08÷0.1=681.6 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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