酪氨酸酶活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
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溶液的配制:
1、 试剂一:临用前每瓶加入 7 mL 提取液充分溶解待用,现配现用。溶解后易氧化,24h 内要尽快用完。
产品说明:
酪氨酸酶(tyrosinase:EC1.14.18.1)是一种单酚单加氧酶,是具有双功能的含铜糖蛋白,广泛存在于植物、酵母和动物组织中。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶,也是引起果蔬酶促褐变的主要因素,同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响
酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素,其在475nm下有特征吸收峰,进而测定出酪氨酸酶的活性。
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/4d41502b-4783-43ef-aa14-b92728c969cb.jpg)
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、细胞超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200w,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。12000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆):直接检测。若有浑浊则离心后去上清使用。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至475nm。分光光度计蒸馏水调零。
2、 加样表(在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入)
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将上述试剂分别加入比色皿/96 孔板中后迅速吹打混匀,记录第 10s 的吸光值 A1,迅速置于 37℃ (哺乳动物)或 25℃ (其他物种)水浴或培养箱中 3min,拿出迅速擦干测定 3min10s 时的吸光值 A2,计算ΔA =A2 -A1。
三、酪氨酸酶酶活计算
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注意事项:
1. 1、当分光光度计ΔA大于0.3或酶标仪ΔA大于0.2时,建议将样本用提取液稀释后测量;ΔA过小时,建议增加酶促反应时间(5min或10min)或增加加入的样本体积来测定。计算时注意同步修改计算公式。
实验实例:
1、 取 0.1g 稗 草 叶 加 入 1mL 提 取 液 进 行 匀 浆 研 磨 , 取 上 清 后 按 照 测 定 步 骤 操 作 , 测 得 计 算ΔA=A2-A1=0.0821-0.0368=0.0453,使用微量石英比色皿按样本质量计算酶活得:
酪氨酸酶(U/g 质量)=90.09×ΔA÷W=90.09×0.0453÷0.1=40.81U/g 质量。
2、 取 0.1g 土 豆 加 入 1mL 提 取 液 进 行 匀 浆 研 磨 , 取 上 清 后 稀 释 4 倍 按 照 测 定 步 骤 操 作 , 测 得 计 算ΔA=A2-A1=0.2021-0.0239=0.1782,使用微量石英比色皿按样本质量计算酶活得:
酪氨酸酶(U/g 质量)=90.09×ΔA÷W×F(稀释倍数)=90.09×0.1782÷0.1×4=642.16U/g 质量。
3、 取兔血清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA=A2-A1=0.2981-0.2556=0.0425,使用微量石英比色皿按样本体积计算酶活得:
酪氨酸酶(U/mL)=90.09×ΔA=90.09×0.0425=3.83 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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