线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测试剂盒 微量法

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格: 100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液二：易挥发试剂，用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存；

2、 试剂一：临用前加入 5 mL 试剂三，充分溶解待用；

3、 试剂二：临用前加入 5 mL 试剂三，充分溶解待用；

4、 试剂四：临用前加入 0.375 mL 双蒸水，充分溶解待用；

5、 标准品：10 mg α-酮戊二酸。临用前加入 684 μL 蒸馏水，配成 100 μmol/mL 标准液；

6、 工作液的配制：临用前根据用量将试剂一、试剂二按 1:1 比例混合，现配现用。

产品说明：

线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。

异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD还原成NADH，通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约 0.2 g 组织或收集 1000 万细胞，加入 1mL 提取液一和 10μL 提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 4℃，1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 400μL 提取液三和 4μL 提取液二，超声波破碎（功率 40%，超声 5 秒，间隔 9 秒，4min），4℃，10000g 离心 10min，取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL标准溶液。

3、 操作表（在0.6 mLEP管/96孔板中进行如下操作）：

三、ICDHm活性计算

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

2、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

实验实例：

1、 取 0.2g 小鼠肾脏加入 1.5 mL 提取液一和 15 μL 提取液二，用冰浴匀浆器匀浆。4℃，1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物，在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL提取液二，超声波破碎，4℃，10000g 离心 10min，取上清液，分别按操作步骤检测，用 96 孔板测得：胞浆 ΔA测定=A 测定管-A 对照管=0.25-0.25=0，线粒体 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.433-0.279=0.154，带入标准曲线 y=0.5533x+0.0319 计算 x 值，按样本质量计算酶活得：胞浆中 ICDHm 活性（U/g 质量）=16.83×x÷W=0U/g 质量，线粒体中 ICDHm 活性（U/g 质量）=6.73×x÷W=7.43 U/g 质量，样本总 ICDHm（U/g 质量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W=7.43 U/g 质量。

2、 取 0.3g 黑麦草加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二，用冰浴匀浆器匀浆。4℃，1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物，上清液稀释 2 倍，在沉淀中加入 600μL提取液三和 6μL 提取液二，超声波破碎，4℃，10000g 离心 10min，取上清液稀释 2 倍，分别按操作步骤检测，用96孔板测得：胞浆ΔA测定=A测定管-A对照管=0.377-0.34=0.037，线粒体ΔA测定=A测定管-A对照管=0.711-0.649=0.062，带入标准曲线 y=0.5533x+0.0319 计算 x 值，按样本质量计算酶活得：胞浆中 ICDHm 活性（U/g质量）=16.83×x÷W×2=1.55 U/g 质量，线粒体中 ICDHm 活性（U/g 质量）=6.73×x÷W×2=3.66U/g 质量，样本总 ICDHm（U/g 质量）=16.83×x÷W×2+9.16×x÷W×2=5.21 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！