中性转化酶(NI)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060702365452014](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060702365452014.png)
溶液的配制:
1.试剂二:临用前加入 30mL 试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存;
2.标准品:10mg 葡萄糖,临用前加入 1mL 蒸馏水溶解,制备 10mg/mL 葡萄糖标准液备用。
产品说明:
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,将高等植物 Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。NI 主要存在于细胞质中,负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。
NI 催化蔗糖分解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算 NI 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min,调节波长至540mm,蒸馏水调零。
2、标准品的制备:将标准品用蒸馏水稀释成1.0、0.8、0.6、 0.4、0.2、0mg/mL葡萄糖标准液,
4、操作表(在1.5mL EP管中依次加入下列试剂)
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混匀,煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分流失),流水冷却后充分混匀,540nm 处蒸馏水调零,记录各管吸光值 A,ΔA=A 测定-A 对照。
三、NI 活性计算
![image 2022060702374012586](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060702374012586.png)
注意事项:
1、如果加入试剂三,煮沸 10min 后有混浊物出现,建议离心除去沉淀后,取上清测定吸光度。
2、如果吸光值大于 1,可以用蒸馏水将样本稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)。
3、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例:
1、 取 0.1g 冬青加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照步骤操作,测得计算 A 测定=0.778,A 对照=0.774,ΔA=A 测 定 -A 对 照 =0.778-0.774=0.004, 带 入 标 准 曲 线 y = 0.9582x - 0.123, 计 算 x=( 0.004+0.123)/0.9582=0.13254,按样本质量计算酶活得:
NI 活性(U/g 质量)=33.3 ×x÷W =33.3 ×0.13254÷0.1=44.136 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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