糖原合成酶(GCS)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂四:提供一个 5 mL 试剂瓶,用前取 1 支加入 3mL 试剂一充分溶解,-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
2、 试剂五:提供一个 5 mL 试剂瓶,用前取 1 支加入 3mL 试剂一充分溶解,-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
3、 工作液的配制:临用前将试剂三离心,取 20 μL 试剂三,加 14 mL 试剂一、3 mL 试剂四、3mL 试剂五,充分混合(约 26T),现用现配,也可根据样本量按比例配制;
4、 试剂八的配制:
(1) 临用前取 1 瓶试剂八中加入 6mL 试剂二充分溶解,再将 1 支试剂七转移到试剂八中混合溶解后待用,可-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
(2) 用前先将试剂六离心,取 55 μL 试剂六加入 5.74 mL 上述(1)中溶液,充分混合(约 28T),现用现配,也可根据样本量按比例配制。
产品说明:
糖原合成酶(Glycogen synthase , GCS)将UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非还原端,以α-1,4糖苷键连接。GCS是动物机体糖原合成过程的限速酶,同时也是胰岛素作用的主要靶酶,在糖代谢及维持血糖相对稳定的过程中有着重要作用。
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH生成NAD+,在340 nm下测定NADH的下降速率,即可反映GCS活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率 200w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
血清等液体:直接检测。(若溶液浑浊则离心后取上清进行测定)
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 临用前将工作液与试剂八置于37℃水浴锅中预热5min(工作液用多少预热多少)。
3、 操作表:在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂:
三、GCS 酶活计算
注意事项:
1、 样本提取上清液置于冰上待测,提取样本建议当天测完。
2、 若ΔA大于0.2,建议将样本用提取液稀释适当倍数后测定,以提高检测灵敏度,并在计算公式中乘以相应的稀释倍数。
实验实例:
1、取0.1g小鼠心脏加入1mL提取液进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.177-1.119=0.058,ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.944-0.939=0.005,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.058-0.005=0.053,按照样本质量计算酶活得:
GCS酶活(U/g 质量)=3215.4×ΔA÷W=1704.162 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!