乙酸激酶(ACK)活性检测试剂盒 紫外分光光度法

乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：临用前将试剂九加入到提取液中，并于 4℃保存；

2、 试剂二：临用前每瓶加入 4 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；

3、 试剂三：临用前每瓶加入 3 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

4、 试剂四：临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

5、 试剂五：临用前每支加入 1 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

6、 试剂六：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 43:457（V:V）的比例配制备用，现用现配；

7、 试剂七：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂七、蒸馏水按 1:9（V:V）的比例配制备用，现用现配；

8、 试剂八：临用前加入 5 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；

9、 工作液：吸取 0.3 mL 试剂二、1 mL 试剂三、0.65 mL 试剂四、0.2 mL 试剂五、0.2 mL 试剂六、0.2 mL试剂七、1 mL 试剂八混匀，也可根据比例现用现配，于冰上备用。

产品说明：

ACK广泛存在于生物体内，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理如下：（1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD⁺速率，即可反映ACK活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或细胞处理：

收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或

细胞（功率 20%，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：

称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测

3、血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温15min。

3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 3 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 3 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA 测定=A 测定 1-A 测定 2，ΔA空白=A 空白 1-A 空白 2，计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。

三、ACK活力计算

V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V提取：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、 ΔA大于1时，建议稀释后测量，注意计算公式乘以稀释倍数；ΔA小于0.01时，建议延长反应时间测量，注意计算公式变化。

实验实例：

1、 取 0.1g 肾脏组织样本，加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A测定 1-A 测定 2=1.893-1.147=0.746，ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2=1.453-1.448=0.005，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.746-0.005=0.741，按样本质量计算酶活得：

ACK（U/g 质量）=536×ΔA÷W=536×0.741÷0.1=3971.76 U/g 质量。

2、 取 500 万大肠杆菌加入 1mL 提取液超声破碎，离心，取上清后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A 测定 1-A测定 2=1.476-1.448=0.028，ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2=1.453-1.448=0.005，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.028-0.005=0.023，按细菌数量计算酶活得：

ACK（U/10⁴ cell）=1.072×ΔA=1.072×0.023=0.0247 U/10⁴ cell。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！