果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)检测试剂盒 紫外分光光度法

果糖-1.6-二磷酸醛缩酶（FBA）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

2、 试剂三：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3、 试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

4、 试剂五：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：

果糖 1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FBA）（EC4.1.2.13）是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与 calvin 循环的重要酶，催化果糖 1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和 3-磷酸甘油醛，广泛存在于动植物及微生物体内，在各种逆境胁迫下表现不同的响应。果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和 α-磷酸甘油，340nm 处吸光值的变化可反映果糖 1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、分析天平、低温离心机、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

①总 FBA 酶：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液一）充分冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一），冰浴超声波破碎细菌或细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

液体：直接检测。

②胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离：

（1） 按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），手工快速研磨或匀浆，之后于 4℃，200g 离心 5min；

（2） 弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min（离心时缓慢加速和降速）；

（3） 取上清用于测定胞浆 FBA 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，上清即为叶绿体中 FBA 酶活性。

建议测定总FBA酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBA，则按照步骤②提取粗酶液。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定：(在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂)

注意：如果检测样本量大，可以将试剂一、二、三、四、五按照5:1:1:1:1（V:V:V:V:V）的比例配成工作液待用（现配现用）。

注意事项：

1. 若 ΔA 大于 0.8 建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2. 若是植物样本，建议在提取完成后 2h 内检测完，如果样本量过大，建议分批提取、检测。

3. 由于提取液一中含有一定浓度的蛋白（约 0.5mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋

白含量。

实验实例：

1、 取0.1g小鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释8倍后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2 测定=1.257-1.06=0.197，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=1.164-1.16=0.004，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.197-0.004=0.193，按样本质量计算酶活：

FBA 酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×8（稀释倍数）= 321.54×0.193÷0.1×8（稀释倍数）=4964 U/g 质量。

2、 取 0.1g 绿萝加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2测定=1.438-1.386=0.052，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=1.164-1.16=0.004，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.052-0.004=0.048，按样本质量计算酶活：

FBA 酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W= 321.54×0.048÷0.1=154.3392 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！