Caspase 3 活性检测试剂盒

产品概述

Caspase-3 活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用比色光度法法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。 Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP，ICAD，gelsolin和fodrin等。这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA片段化等。同时caspase 3对细胞起泡也起到关键作用。 本Caspase 3 活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化Caspase-3底物产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。 本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-3检测。 还可以提供荧光标记的Caspase-3 活性检测试剂盒。荧光法检测的灵敏度远高于分光光度法，有荧光检测条件者尽可能选择荧光法的检测试剂盒。没有荧光检测条件，可以选择比色法Caspase-3活性检测试剂盒，需要确保样品中Caspase-3活化程度足够高。

保存温度

2-8℃避光

注意事项

1.Caspase-3底物短期4℃避光保存，长期-20℃避光保存；。

2.Caspase底物在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。

有效期

1年

检测方法

1.酶标仪

2.分光光度计

适用样本

1.细胞

2.组织

产品应用

1.酶标仪

2.分光光度计

仪器准备

1.酶标仪/分光光度计

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））

2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

使用注意事项

1.须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405。

2.37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。

3.如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500ug每样。

4.如果样品中激活的caspase水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。

5. Caspase-3底物避光保存，使用过程中尽量避光。

6. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

7. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。

使用方法

一、 裂解缓冲液和检测缓冲液配制

根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10ul DTT。

充分混匀置冰上备用。

二、 样品处理

A． 细胞样品

1. 收集2-5×106个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 在细胞中加入50μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。

4. 置冰上持续振荡15-45分钟。

5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。

6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

B． 组织样品

1. 取适量组织样本剪碎，按照50mg/100μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨）。

2. 冰上振荡15-45分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。

3. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。

4. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

三、 对上述处理过的上清进行蛋白定量。

四、 Caspase 3活性检测

1. 取50ul大约含100-200ug蛋白的裂解上清，加入40ul检测缓冲液。

2. 再加入10ul caspase-3底物，充分混匀。在37℃下避光反应1-4小时，有黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育过夜。部分样品中激活的caspase-3水平较低，颜色变化不明显，直接上机检测，与对照组样品产品变化即可。

3. 测定A405nm或A400nm。

4. 根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的Caspase 3活性程度。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！