真空冷冻干燥技术在细胞生物学领域的应用

物学研究与临床经常需要使用到红细胞，然而血液红细胞的采集过程比较繁琐，并且有些珍贵血液采集机会难得，所以就需要有效的保存液来维持所采集的红细胞的活性。然而，目前大部分血液是在4℃的冰箱保存，保存时间仅为20天左右，难以满足长时间保存的需要；此外，红细胞的保存液多采用常温下的短期保存和深低温下的长期保存，因此保存和运输存在很大困难。并且随着保存时间的延长，红细胞易被氧化损伤，红细胞膜结构和功能会发生改变，进而影响其稳定性及功能性。

01 应用背景

近年来，对于蛋白及红细胞的保存大多是采用冷冻干燥技术，即通过低温与真空条件的控制，一方面能使蛋白及红细胞中的热敏成分与易氧化成分不被破坏损伤，另一方面还能阻止微生物生长以及水为介质的生化反应等，从而使蛋白及红细胞保持其原有的生物活性。通过冷冻干燥后的红细胞能够实现常温下的长时间保存，并且其性能稳定、输注方便、便于运输，在新医疗领域具有重大的应用价值。

然而，红细胞在冻干及复水的过程中极易受到外界的影响，导致红细胞冻干后复水的存活率不是很高；而且目前研发的细胞冻干保护剂存在成分复杂、冻存工艺参数不易控制等缺陷，使得红细胞存活率低、冻存红细胞易发生形态变异、冻干红细胞酶活性低等。因此，寻找一种安全性高，冻干红细胞存活率高、活性高的红细胞冻干与复水工艺，是推广红细胞临床使用的关键。

02 影响干燥速率的因素

近年来，研究发现有机溶剂的存在可以影响溶液的冻结特性，进而可能影响干燥速率和冻干品的外观。叔丁醇作为有机溶剂的一种，深受众多研究者关注，但是它对红细胞冷冻干燥过程的影响如何，对红细胞回收率是否有影响也从未见报导过。专家指出，渗透性保护剂与非渗透性保护剂的联合使用能达到较好的冷冻前脱水目的。采用40%渗透性保护剂甘油对红细胞进行预处理，再加入非渗透性冻干保护剂进行冻干的方法来研究渗透性保护剂预处理对红细胞冻干效果的影响。采用无损的微CT扫描技术，对正在升华过程的红细胞样品进行扫描观察，以期探索叔丁醇对干燥过程的影响。通过对冻干红细胞样品进行CT扫描，计算得到孔隙率，判断甘油对红细胞体积的影响，认识叔丁醇浓度对冰晶大小的影响。利用血球计数板进行冻干前后细胞计数，得到甘油和叔丁醇的共同作用情况。

在红细胞冷冻干燥过程中，利用微CT扫描技术进行样品升华干燥过程的定时扫描观察，并对冻干品进行内部结构扫描分析，同时计算得到各个样品的孔隙率值。对冻干后的样品，采用三步法复水，用血细胞计数板进行检测。实验结果表明，有机溶剂叔丁醇可以加速冻干过程，缩短干燥时间，并且浓度为10%的比5%的显著。在升华过程中，孔隙率呈下降的趋势。最高的孔隙率出现在含有10%叔丁醇的经甘油预处理的保护剂配方中。经过甘油预处理，细胞的恢复率得到了明显的提高，而叔丁醇的加入，导致一定程度上的恢复率下降。

03 冻干设备推荐

富睿捷原位冻干机Mercury系列0.1㎡、0.3㎡机型，不仅可以做冻干处理，还能真正实现整个冻干过程可控，使得样品冻干效率更高，能耗更低，冻干的品质更佳，样品结果均一性高，冻干工艺的重复性好。另外，还可以实现冻干工艺的摸索，优化，放大工艺，共晶点测试等。制冷系统采用自主研发混合制冷技术，可实现温度更低，稳定性更好。不锈钢冷阱的冷凝温度最低达-80°C左右，冻干仓真空度可达 0.2Pa。红细胞样品冻结至-50°C左右，保持1h后开始抽真空，一次干燥搁板温度为-30°C，持续30h；二次干燥温度为10°C，持续10h，真空度低于10Pa。

原位冻干机优势：

• 内置直立式不锈钢冷阱盘管，能够更彻底捕获样品冻干过程中升华的水汽，使得冻干仓里的水汽更少，避免水汽在冻干仓內形成內循环，让仓体內的水汽液化成液滴附着在样品，整个过程是放热反应，如若处理不当会造成有些样品融化、变质或坍塌等；

• 标配高精度皮拉尼真空计，保证真空度的准确性，能够更好的完成冻干实验，最终实现品质、效率，能耗的平衡；

• 标配冻干终点判定系统，系统可以提醒用户样品是否冻干完成，十分便利，避免采样检测，外.挂检测等，让整个实验过程省时，省心，省力。

• 预冻温度可达-80℃，可充分保证样品冻结状态，做好样品的预冻处理，也保证了诸如一些低共晶点样品不会因为温度不够而融化或预冻不结实等问题。

• 隔板温度范围-55℃到55℃；更大的温度调控范围，为冻干曲线摸索和优化，工艺放大提供便利条件，提供更大范围的冻干过程的隔板温度调控，实现冻干效率的最大化，包括探寻最佳的冻干曲线等。

• 隔板的温差为±1℃，能够保证均一性，合格率更高。

微CT技术可以无损的对物料内部进行检测，通过把微CT扫描技术引入到红细胞冷冻干燥中，进行干燥过程的定时扫描观察，并对冻干品进行内部结构重构分析，得到结论为有机溶剂叔丁醇可以加速冻干过程，缩短干燥时间，10%浓度的叔丁醇效果比5%的显著很多；在升华过程中，孔隙率呈下降的趋势，因为由叔丁醇形成的针状冰晶和甘油预处理所导致的细胞体积增大，最高的孔隙率出现在含有10%叔丁醇的经甘油预处理的保护剂配方中，经过甘油预处理，细胞的恢复率得到了显著的提高，而加入叔丁醇，细胞的恢复率又显著下降。由于叔丁醇升华过程留下了管状通道含10%叔丁醇的保护剂配方可以更好的保持细胞的完整性。

04 总结

总之，把叔丁醇引入到红细胞的冷冻干燥中是否恰当，以减少细胞恢复率为代价的缩短冻干时间是否值得，还有待深入研究。此外，在药品的冷冻干燥过程中，如果干燥时间过长，则药性或者其作用成分将会受到影响，故而加快干燥过程的进行很有必要，如果能把叔丁醇引入到药品的冻干生产上，将会产生十分可观的效益。

富睿捷致力于服务各个有冷冻干燥需求的领域，专业售前人员根据您的样品需求提供一站式的冻干解决方案，让您全身心投入到实验研究中，免除后顾之忧。同时，富睿捷也可提供免费做样服务，如有冻干需求，可联系我们。

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