真空离心浓缩DNA样本在法医学中的应用研究

微量疑难检材提取时，制定正确的纯化、浓缩方案是检验成功的关键，本研究采用真空离心浓缩技术对法医DNA样本进行浓缩，提高检验成功率。

一、实验过程

1、不同浓度样品浓缩

将2800M（1ng/ μl）、007（0.05 ng/ μl）、 9947A（0.005 、0.01 、0.02 、0.04 ng/ μl）、去离子水各1份，同时在 45℃的真空离心浓缩仪中离心管管盖开启浓缩至干燥，再分别加入去离子水10μl ， 震荡离心后PCR扩增。

2、不同温度浓缩已知浓度样品

30 份007分成3组，每组10份，分别在30℃、45℃、60℃的真空离心浓缩仪中开盖浓缩至干燥，再分别加入去离子水10μl，震荡离心后PCR扩增。

3、现场物证 DNA 模板浓缩

现场物证DNA模板48份在45℃真空离心浓缩仪中开盖浓缩至干燥。无明显分型的23个样本加入去离子水6μl；分型不全的25份样本加入去离子水 10μl，震荡离心后PCR扩增。

4、扩增和检测

按GlobalFilerTM 试剂盒说明书操作，扩增体系为 10μl，循环次数为 29 次，已知浓度样品1μl扩增，现场物证DNA模板6μl扩增。使用3500型基因分析仪电泳检测。

5、数据分析

采用某软件进行数据分析。相对荧光单位（Relative Fluorescence Units ，RFU）阈值设为175，13个及以上常染色体基因座获得明确分型的为有效分型。GeneMapper® ID-X 软件分析后导出包括Yindel 、DYS391 和性别位点在内的24个基因座的相关数据，使用 EXCEL 软件计算平均值、标准差和计数。

二、实验结果

1、已知浓度样品浓缩结果

已知浓度样品、阴性对照未发现污染。2800M （1ng/ μl）、007（0.05 ng/ μl）、9947A（0.02 、0.04 ng/ μl）浓缩后均获得正确分型。低浓度的9947A （0.005 、0.01 、0.02ng/ μl）浓缩后图谱分型质量改善尤其明显， 等位基因丢失减少，峰值均衡性更佳， 峰高显著提高，检出正确分型的基因座数分别由7 个、 11 个、16个增加到 21个、21个、22个。

007分别在 30℃、45℃、60℃浓缩后，均获得正确分型，但峰高有差异。不同组间平均峰高 60℃ 最大、30℃最小，同组中平均峰高的标准差45℃最 大、30℃最小。温度越高， 浓缩干燥所需时间越短。 检验结果见表 1。

浓缩是微量疑难检材提取中常用的方法，目前主要有Amicon 离心超滤管 、DNA Clean & ConcentratorTM  - 5 试剂盒、Microcon 100 法等等。以上浓缩均需在不同的管柱间转移DNA模板，不可避免造成DNA损耗，同时增加了污染的概率。使用恒温混匀仪浓缩DNA的物理浓缩法，在模板体积较大时耗时长，且DNA模板长时间直接暴露在空气中，有环境和检材相互污染的风险。真空离心浓缩技术是改良的物理浓缩法，其原理是利用离心力、加热和真空作用挥发液体，达到浓缩、干燥DNA的目的。在达到固定转速后启动真空抽吸， 挥发的液体回收至密闭容器，有效避免样品交叉污染和实验室污染。本研究中未发现样品间污染。该方法可同时浓缩数十个样品，通过去离子水量调节浓缩倍数，具有一定的简便性和灵活性。

本研究中已知浓度样品经浓缩后，均获得正确分型，图谱质量明显提高，尤其是低拷贝数目（LCN） 样品。9947A（0.005 、0.01 、0.02 ng/ μl）检出正确  分型的基因座数量分别由 7 个、11 个、16 个增加到  21 个、21 个、22 个。不同温度下浓缩 007 均能获得正确分型，但峰高有差异。30℃获得的图谱结果最稳定，但平均峰高最大值小于45℃、60℃的峰高平均值，浓缩效果最差，浓缩时间最长，因此不推荐使用 30℃浓缩。本研究中选用的现场物证DNA模板是磁珠法提取纯化的，抑制物较少，浓缩前检测均分型不全，考虑为微量 DNA 样本。

真空离心浓缩技术有以下特点：

①浓缩时间相对短。45℃下，恒温混匀仪干燥50μl液体耗时8小时以上，真空离心浓缩技术仅需约1小时；

②浓缩和回收液体均在密闭环境中，降低实验室污染风险；

③操作便捷，浓缩倍数灵活，浓缩过程一管完成， DNA损耗少；

④经济实用。该方法仅需一台真空离心浓缩仪，即可在现有的提取纯化方法基础上长期应用。

综上，真空离心浓缩技术适用于提取纯化后模板体积较大、抑制物少、原检验图谱分型不理想的 DNA 样本浓缩，可以提高微量疑难检材的检验成功率。

文章来源：中国法医学杂志  CHIN J FORENSIC MED   2019 年第 34 卷第 5 期杨静开，刘振平 ，金胄 ，傅新爱著

四、富睿捷离心浓缩仪