您好，欢迎访问仪器信息网

搜全站

搜展位

迈安纳（上海）仪器科技有限公司

关注

已关注

银牌4年

已认证

粉丝量 0

400-860-5168转4874

仪器信息网认证电话，请放心拨打

全部分类

首页

新型环状mRNA瘤内递送用于免疫调节和癌症治疗

迈安纳

2022/01/13 15:05

阅读：23

1641881092(1).png

原文地址：https://doi.org/10.1101/2021.11.01.466725

近来，一些聚焦于环状mRNA的研究，证明其在体外可以产生强效和持久的蛋白表达。尽管大部分真核生物中的环状mRNA被认为是非编码RNA，但一些环状mRNA被认为可以编码和表达蛋白。这些环状mRNA在体内大多是通过索尾插接的机制形成。经过几十年的发展，环状mRNA可以在体外通过不同的方式合成，包括T4连接酶催化的连接，化学策略用于5’和3’端的交联，核酶策略用于分子内共价键的形成和环状mRNA的产生。

1992年，M.Puttaraju和Michael D.Been报道，基于鱼腥藻I组内含子，他们发明了I组内含子-外显子置换系统（PIE）以实现核酶催化的体外自主剪切，并可以形成一个外显子-外显子共价连接的环状RNA。在这种情况下，外源核苷酸序列插入外显子和内含子位点之间，产生包含外源RNA片段的环状RNA。基于此PIE系统，R. Alexander Wesselhoeft等人做出了一系列优化，增加同源臂和间隔序列产生更大的环状RNA，增加内部核糖体进入位点（IRES）增加蛋白翻译效率。他们筛选了不同病毒来源的IRES元素，发现IRES CVB3是一种高效的cap非依赖的翻译元件。更重要地，他们发现这种类型的CVB3 IRES驱动的环状mRNA相比线型mRNA可以有更强效和持久的蛋白表达。他们进一步发现环状mRNA经过HPLC纯化后，免疫原性非常低，表明纯化的环状mRNA可能适合体内应用。然而，还需更多的研究证明环状mRNA适合临床应用。

本研究中，我们基于Echovirus 29来源的IRES，同源臂，和间隔RNA构建了一种新型的环状mRNA，C-RNA。我们首次证明，编码一系列细胞因子的环状mRNA能够直接用于瘤内给药，调节瘤内的和系统性的抗肿瘤免疫反应，增强抗PD-1抗体的免疫效应，最终实现肿瘤的消除。

1. C-RNA的构建和确认

本研究中，包含了T7启动子，PIE系统，IRES和新型RNA间隔序列的载体用于环状mRNA的合成。Fig.1A和1B表明，IRES E24, E29, E33诱导中等或强效的的EGFP表达。基于E29的C-mRNA在HEK-293T细胞中介导的蛋白表达可以持续11天以上。如Fig.1G所示，本研究中C-mRNA由E29 IRES，蛋白编码区域，间隔序列和Exon2-Exon1接合区域组成。此外，我们发现HPLC纯化后的C-mRNA相比未纯化的，在A549细胞中有更高的蛋白表达（Fig.1E和Fig.1F）。这个结果表明对于C-mRNA，HPLC纯化不论是对去除免疫原性还是促进蛋白表达都是至关重要的。

Fig.1 C-RNA的构建和确认

2. C-RNA指导体内外蛋白表达

接下来，本研究证明了C-RNA可以指导几种不同的蛋白的表达。如图Fig.2A所示，在肌肉注射6h，24h之后，小鼠肝脏和注射部位都保持高水平的荧光素酶活性，表明C-RNA主要靶向于肝脏，并且介导高水平的蛋白表达。荧光素酶的表达可以在注射部位持续9天以上，表明C-RNA可以介导持续性的蛋白表达。此外，我们还研究了C-RNA介导分泌蛋白和跨膜蛋白的表达能力。Fig.2B显示RNA转染24h之后，两种跨膜细胞因子IL-15 CD8α和IL-15 GPI在细胞膜上显著表达。Fig.2C显示SARS-Cov2的受体结合区（RBD）C-RNA转染293T细胞24h后，在细胞培养上清液中检测到高水平的分泌型重组RBD三聚物蛋白。同时，我们用脂质纳米粒（LNP）包裹的RBD C-RNA转染小鼠，在小鼠血清中检测到高水平的RBD三聚物蛋白。总之，C-RNA能指导胞内蛋白、分泌型蛋白和跨膜蛋白的体内外表达。

Fig.2 C-RNA指导体内外蛋白表达

3. 瘤内注射C-RNA实现在肿瘤组织中的特异性表达

2017年，Yanping Kong等人报道肿瘤细胞可能通过过度激活的内吞途径，摄取大小在57-1620bp的DNA。基于此，我们推测环状mRNA可能也可以通过同样的机制被肿瘤细胞摄取。Fig.3A显示，C-RNA瘤内注射6h后观察到明显的生物荧光，而其他注射方式，皮下注射，皮内注射，肌肉注射，腹腔内注射和静脉注射则没有荧光。Yanping Kong等报道这种对裸露DNA的摄取与肿瘤细胞的类型有关。Fig.3B显示C-RNA在A549，NCI-H358，MC38移植瘤模型中均能有效表达，表明其在多种肿瘤中表达的潜能。

Fig.3 瘤内注射C-RNA实现在肿瘤组织中的特异性表达

4. 瘤内注射C-RNA实现高效持久的蛋白表达

Fig.4A显示C-RNA相比线型mRNA在293T细胞中可以介导更高水平和持久的蛋白表达。之后我们比较了两者在体内的表达差异，Fig.4B和4C显示在注射4，24，48，72，96h后，C-RNA组比线型RNA组有更强的荧光活性，并且荧光的消减更缓慢。

Fig.4 瘤内注射C-RNA实现高效持久的蛋白表达

5. 优化C-mRNA处方促进瘤内递送和蛋白表达

2007年J Probst报道通过皮肤注射时，Ca2+影响裸露线型mRNA的胞内递送。本研究我们使用不同的组分作为C-RNA的溶剂，包括0.9%NaCl，PBS，1X TE缓冲液，林格氏液，其中林格氏液展现了最强的荧光素酶表达（Fig.5A）。林格氏液中含有CaCl2, NaCl, KCl and NaHCO3, 我们分别移除一种成分，观察对蛋白表达的影响。结果显示CaCl2，KCl对C-RNA的胞内递送影响最大。

Fig.5优化C-mRNA处方促进瘤内递送和蛋白表达

6. 编码细胞因子的C-RNA促进抗PD-1抗体介导的肿瘤抑制

细胞因子对于肿瘤微环境的调节至关重要。本研究中我们分别制备了编码IL-15，IL-12，GM-CSF，IFN-α2b的C-RNA。Fig.6B显示转染293T细胞24h后，这些细胞因子的表达水平较高。之后，每个转染组的上清液被收集并转移到外周单核细胞（PMBC）的培养液中用于评估分泌的细胞因子的活性。如Fig.6C所示，细胞因子组合可以显著上调PMBC中CD69阳性的CD4+，CD8+ T细胞的比例。接下来，编码多种细胞因子的C-RNA混合物使用林格氏液作为溶剂，比较它们对B16F10移植瘤小鼠的作用。Fig.7A和7B显示联合治疗组（细胞因子组合+抗PD-1抗体）对肿瘤生长抑制效果显著，延长了小鼠生存时间。同时，我们在MC-38移植瘤小鼠模型中再次验证细胞因子组合和抗PD-1抗体的协同效应有效抑制了肿瘤生长，改善了最终生存率，3/8的完全响应率（Fig.7C和7D）。

Fig.6编码细胞因子的C-RNA促进抗PD-1抗体介导的肿瘤抑制-1

Fig.6编码细胞因子的C-RNA促进抗PD-1抗体介导的肿瘤抑制-2

7. 编码细胞因子的C-RNA通过T细胞浸润和激活以抑制肿瘤生长

我们按照Fig.8A图示进行两种方法的联合治疗，使用流式细胞仪分析肿瘤浸润性T细胞。Fig.8B显示联合治疗显著增加了CD45+T细胞比例，表明C-RNA协同抗PD-1抗体促进了整体白细胞的肿瘤浸润。Fig.8C显示抗PD-1抗体仅实现0.6%的浸润型T细胞，而联合治疗组达到6%的肿瘤浸润。Fig.8D显示细胞因子组合，或细胞因子组合+抗PD-1抗体组的CD69+ T细胞占总CD4 T细胞的比例高达80%，而抗PD-1抗体单一疗法组的比例为60%。总之，联合治疗不仅导致更多的免疫细胞，尤其是T细胞募集到肿瘤部位，并且T细胞的激活程度更高，从而产生更强效的抗肿瘤效应。

Fig.8 编码细胞因子的C-RNA通过T细胞浸润和激活以抑制肿瘤生长

8. 总结

本研究构造了一种新型的环状mRNA，可以实现E29驱动下的蛋白的高效表达。这种环状mRNA相比线性mRNA更稳定，可以介导更高效、更持久的蛋白表达。HPLC纯化的C-RNA在免疫原性细胞中的表达增加，可能是由于具有免疫原性的5’-ppp内含子片段的移除，表明C-RNA作为一种治疗策略体内应用的安全性。进而，多种蛋白，包括胞内蛋白，跨膜蛋白，分泌型蛋白的成功表达，表明C-RNA可以作为一种通用型的表达载体。相比线性mRNA，C-RNA瘤内注射后可以实现更高效和持久的蛋白表达。瘤内注射编码四种细胞因子的C-RNA的组合，显著激活了肿瘤浸润型T细胞，协同免疫疗法抑制了肿瘤生长。C-RNA由于其制备简单，有效的蛋白表达有望成为mRNA疫苗或其他疗法的一种有效平台。

精彩回顾丨迈安纳参加第四届新型疫苗研发与产业化论坛

年度钜惠丨迈安纳芯片新春感恩活动