口蹄疫液相阻断ELISA实验

口蹄疫液相阻断ELISA实验

用于检测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫O型病毒抗体，适用于动物疫苗免疫抗体定量检测。

一、实验仪器与耗材：

1、 24道多功能移液工作站（十二板位）

2、 FDT-300A-1-TSF 30Oμl吸头一盒

3、 ICF-PS-96U-S 96孔U型底孔板1块

4、 96孔酶标板1块

5、 4道储液槽1个

6、 废弃盒1个

7、 血清样本

8、 PBST溶液

9、 病毒抗原

2、 实验步骤

96孔酶标板检测20份样品布局图

第一步，分装PBST溶液

1、 用24道多功能移液工作站取10个吸头，将75μl PBST溶液分两次加入酶标板的A1-A10、E1-E10，将吸头退至废弃盒。

2、 取1个吸头将50μl  PBST溶液加入A11、E11、A12和B12，将吸头退至废弃盒。

3、 取11个吸头加50μl PBST 溶液加入B1-H11。将吸头退至废弃盒。

第二步，血清样本稀释

1、 取检血清在第1~10列，从1:4(即A1~A10孔75ul PBST加25μl被检血清)稀释至1:512;

第三步，阳性对照稀释

1、在第11列稀释阳性对照血清，从1:2(即A11孔50μl  PBST加50μl阳性对照血清)稀释至1:256;

第四步，阴性对照稀释

1、 A12~B12孔稀释阴性对照血清，从1:2稀释至1:4;

第五步，分装病毒抗原

1、 将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50u /孔的量加入到被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内。

2、 E12~H12孔为病毒抗原对照孔，仅加入100m/孔稀释至工作浓度的病毒抗原。

第六步：

将抗原抗体混合液从U型反应板上按次序转移至巴包被口蹄疫O型免抗的ELISA板上，504L/孔，封板，37℃温育60分钟。

第七步：

用PBST连续洗板3~5次，拍千，按50y/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体工作液(红色)，封板，37℃温育30分钟。

第八步：

同上洗板3~5次，拍干，按50u孔加免抗豚鼠IgG-HRP工作液(蓝色)，封板，37℃温有30分钟。

第九步：

同上洗板3~5次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1:1比例混匀，加入混匀后的底物溶液50u/孔，置37℃显色15分钟。

第十步：

显色反应结束后，加终止液504/孔，终止反应，在酶标仅上读取D450nm值。