BF2桥联Azafulvene二聚体作为高级光热剂使用1064nm激光驱动用于深部肿瘤治疗

图3. TPEBF NP、TPABF NP和OTTBF NP表征

然后，先使用生物相容性两亲性聚合物DSPE-PEG2000将疏水分子封装成纳米颗粒（NPs）（图3a）。透射电子显微镜（TEM）分析表明，TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs表现出一致的球形形貌，直径分别约为93 nm、102 nm和97 nm，小于动态光散射（DLS）结果（133 nm、130 nm和128 nm）（图3b）。值得注意的是，与 TPEBF NPs 和 TPABF NPs 相比，OTTBF NPs 在 1000–1400 nm 的 NIR-II 窗口范围内显示出更宽的吸收，表明它是一种很有前途的在 NIR-II 区域实现光热抗肿瘤的 PTA分子（图 3c）。尽管用于生物应用的 1064 nm 的 MPE 为 1 W cm−2，采用较低的激光功率可增强生物样品的相容性。本文采用了 0.7 W cm−2 的激光功率密度在1064 nm 处评估 NPs 的光热效应。如图3d和图3e所示，在1064 nm激光（0.70 W cm−2） 5 分钟。相比之下，TPEBF NPs和TPABF NPs的温度仅略有升高，分别为27.9 °C和36.4 °C。3种NPs的光热效应差异归因于它们在NIR-II窗口中的不同吸收能力。OTTBF NPs在808 nm处的最高温度增量比较（0.33 W cm−2为31.5 °C），50.5 °C 代表 0.70 W cm−2）和 1064 nm（54.8 °C 为 0.70 W cm−2）还表明，OTTBF NPs在NIR-II区域中的光热转换比在NIR-I区域中具有更好的光热转换（图3f）。为了全面比较NIR-I和NIR-II激光器的深层组织光热转换能力，记录了OTTBF NPs在被不同厚度的鸡组织覆盖后，再在相同功率密度（0.7 W cm−2）下以808 nm或1064 nm辐照5 分钟后的最大温度增量。图3g所示的结果表明，无论覆盖的组织厚度如何，照射1064 nm的OTTBF NPs的温度增量都高于808 nm的温度增量。此外，OTTBF NPs的温度升高表现出激光功率密度和NPs浓度依赖性行为（图3h和3i）。TPEBF NPs和TPABF NPs在808 nm（0.33 W cm−2）的辐照下也表现出相似的行为。TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs的光热转换效率（PCE，η）分别为22.5、37.3和54.1%（图3j和S5）。通过记录交替加热和冷却动作过程中的温度变化，进一步研究了OTTBF NPs的光稳定性。经过五个循环后，OTTBF NPs的最高温度变化可以忽略不计（图3k）。通过检测NPs的吸收强度，研究了NPs的光漂白性能和ROS抗性。在 808 nm 激光 （0.33 W cm−2） 或 1064 nm 激光器 （0.7 W cm−2），OTTBF NPs的吸收强度变化可以忽略不计。然而，在相同条件下，吲哚菁绿（ICG）和ICG NPs的吸收强度急剧下降（图3l）。OTTBF NPs和ICG的比较图也显示在图3n中。在存在各种ROS的情况下，例如次氯酸盐（ClO−）、叔丁基过氧自由基（TBO⋅）和羟基自由基（⋅OH）在浓度为200μM时，ICG的吸收强度比其原始值下降约95%（图3m）。然而，在相同条件下，OTTBF NPs的吸收强度保持不变。TPEBF NPs和TPABF NPs也表现出与OTTBF NPs一样相对较高的化学和光稳定性。此外，三种NPs在不同pH值的溶液中表现出高稳定性。这些结果表明了BF2BAD 受体集成的小型有机 PTA 具有高稳定性和，OTTBF NPs 具有出色的光热转换能力，使其非常适合生物 PTT 应用。

图4. TPEBF、TPABF和OTTBF的理论计算

为了更深入地了解TPEBF、TPABF和OTTBF之间光物理特性的差异，使用密度泛函理论（DFT）和含时DFT（TD-DFT）计算进行了全面的理论研究。在M06-2X-D3/6-31G（d）水平上，使用DFT方法对三个分子的基态几何结构进行了全面优化。在基态，三个分子的LUMO主要位于二氟化硼桥联的氮杂富烯二聚体受体基团的中心核上，而HOMO在整个共轭骨架中基本上是离域的（图4a）。OTTBF（3.00eV）中HOMO和LUMO之间的能隙比TPEBF（3.52eV）和TPABF（3.25eV）中的能隙窄，导致吸收波长发生红移。此外，还计算了垂直激发下TPEBF、TPABF和OTTBF碎片（受体核心和其他部分）之间的电荷转移量。图4b显示的结果表明，与TPEBF（0.41887 e）和TPABF（0.50787 e）相比，OTTBF具有最大的电荷转移量（0.55751 e），导致最强的分子内电荷转移（ICT）效应。这与OTTBF观察到的最长吸收波长一致。无论是在基态还是激发态，在OTTBF中噻吩和相邻苯环之间的二面角是三个分子中最小的。OTTBF的相对平面几何形状解释了上述吸收光谱实验中观察到的较高MEC值。

然后计算三个分子的重组能（λ），以定量评估它们在光激发下的几何弛豫程度，即分子内运动。还提供了键长、键角和二面角对总λ的贡献（图4c-e）。TPEBF、TPABF和OTTBF的总λ分别计算为1772 cm-1、1792 cm-1和1978 cm-1。在这些分子中，OTTBF的总λ最高，表示分子内运动最强。值得注意的是，低频区的法向模是由二面角的变化引起的，与非辐射衰变密切相关。二面角变化对OTTBF总λ的贡献（30.35%）明显高于TPEBF（17.45%）和TPABF（18.72%），表明OTTBF在光激发下经历了更强的非辐射弛豫。总的来说，这些理论计算为TPEBF、TPABF和TPE-BFF之间的光物理性质差异提供了合理的解释。

图5. OTTBF NPs 体外实验

受到OTTBF NPs出色光热性能的鼓舞，本文随后评估了其对4T1和MCF-7细胞的PTT体外疗效。首先，采用MTT法研究了OTTBF NPs的暗细胞毒性。如图5a和5b所示，在与不同浓度的OTTBF NP（0-20μg/mL）孵育24小时后，细胞存活率的降低可以忽略不计，表明具有良好的生物相容性。然而，在1064 nm（0.70 W cm−2）下暴露7分钟后，OTTBF NPs表现出浓度依赖性的光毒性，与20μg/mL OTTBF NPs一起孵育时，细胞存活率显著降至11%。然后，比较了OTTBF NPs在NIR-I和NIR-II窗口下的细胞毒性。图5c显示的结果显示，即使在相同的功率密度下，1064 nm激光治疗组在所有浓度范围内也表现出比808 nm治疗组更高的光毒性。还进行了深层癌症细胞的光热治疗实验，以验证NIR-II激活的PTT的优势（图2d和5d）。尽管通过以不同厚度覆盖96孔板上的鸡组织，OTTBF NPs的光毒性相应降低，但在相同条件下，1064 nm激光治疗组的细胞存活率低于808 nm组。这与解决方案中的结果一致（图3g），表明NIR-II中的PTT确实比NIR-I区域中的PTT更适合治疗深层癌症。

通过使用钙黄绿素AM和碘化丙啶（PI）的共染色实验进一步证实了OTTBF NPs的光疗功效，其中绿色和红色荧光信号分别对应于活细胞和死细胞。如图5e所示，在PBS和OTTBF NPs组中可以观察到明显的绿色荧光信号，表明在这些实验条件下细胞毒性可以忽略不计。然而，OTTBF NPs+1064nm组同时显示绿色和红色荧光，红色信号比808nm处理组更强。同时用商业溶酶体染料（Lyso Tracker Green）和负载Cy5染料的OTTBF NPs处理4T1细胞，以研究NPs的共定位（图5f）。Lyso Tracker的绿色通道与红色通道表现出很强的相关性（重叠系数为0.80），表明OTTBF NPs通过溶酶体介导的内吞途径内化到4T1细胞中。据报道，PDT或PTT可能会诱导细胞器降解并引发细胞死亡。为了研究OTTBF NPs介导的潜在溶酶体破坏，本文进行了吖啶橙（AO）染色生物成像。通常，AO在完整的溶酶体中以质子化低聚物的形式发出红色荧光，而在细胞质和细胞核中，它以单体去质子化的形式发出绿色信号。如图5g所示，由于完整的溶酶体，在PBS和OTTBF NPs组中观察到亮红色荧光信号。然而，当暴露于功率密度为0.70 W cm−2的808 nm或1064 nm照射下时，AO信号的消失表明溶酶体的完整性受到严重破坏。通过AV-FITC/PI染色进一步研究了OTTBF NPs光热处理诱导的细胞死亡途径（图5h）。用OTTBF NPs和光（808 nm或1064 nm）处理的4T1细胞显示出比PBS和OTTBF NPs组更强的绿色和红色荧光信号，表明处理组中出现了更多的细胞凋亡或坏死。

图6. 载Cy7的OTTBF NPs（1 mg/mL，100μL）荷瘤小鼠的时间依赖性NIR-II荧光成像

受OTTBF NPs优异的体外光热性能的启发，研究了体内光子热疗抗肿瘤。由于OTTBF NPs的荧光强度相对较低，Cy7染料被共包封在NP中。首先，本文通过静脉注射在荷瘤小鼠体内评估了OTTBF NPs在4T1中的体内肿瘤积聚和生物分布。如图6a和6b所示，给药6小时后，在肿瘤部位观察到明显的NIR-II荧光信号，约36小时后信号达到最大强度，表明OTTBF NPs具有显著的肿瘤积聚能力。同时，主要器官和肿瘤的离体成像进一步证实了OTTBF NPs在肿瘤中的有效摄取和保留（图6c和6d）。

图7. OTTBF NPs对荷瘤小鼠进行NIR-II PPT治疗