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高性能细胞标记近红外二区NIR-II染料用于体内细胞追踪
本文要点：在近红外二区（NIR-II，1000-3000 nm）发射的荧光染料为血管和淋巴系统的实时和高分辨率成像提供了重大进展。然而，在体内NIR-II追踪标记细胞的课题仍然具有挑战性。在这里，我们开发了一种屏蔽单元-供体-受体-供体-屏蔽单元（S-D-A-D-S）NIR-II荧光团（FE-4ZW），带有两性离子末端基团，用于高效细胞标记，而无需使用细胞穿透肽，从而增强了细胞迁移位置的非侵入性体内测定。拴系末端磺基铵内盐具有对细胞膜的高亲和力，因此即使对于固定细胞也能实现稳定的标记。移植干细胞的命运和肿瘤细胞在脑或外周组织中沿淋巴系统的迁移由细胞内化的FE-4ZW清楚地监测。本文还证实，临床使用的表面活性剂D-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯可以减少肝脏和脾脏对FE-4ZW的摄取。本文报道的荧光团设计策略和细胞标记技术为细胞迁移的可视化和对重新定位过程的洞察开辟了一个新的领域，从而最终为更详细地研究干细胞治疗和肿瘤转移的潜在机制提供了机会。
方案1. FE-4ZW作为细胞示踪剂的制造和体内跟踪血液循环和淋巴系统中细胞迁移的图示
本文研究了FE-4ZW和FE-2PEG在单独静脉给药后的体内药代动力学。与循环时间长且具有部分肾排泄特征的FE-2PEG相比，FE-4ZW在短血循环时间（∼50分钟）内在肝脏和脾脏中积累更快。随后，肝脏和脾脏中的荧光信号强度随着时间的推移而增加，逐渐降低（图1A-C和S13）。基于FE-4ZW与FE-2PEG相比更快的肝脏摄取特征，我们假设当FE-4ZW注射到小鼠的血液循环系统中时，它们也被肝细胞和/或巨噬细胞（Kupffer细胞）内吞。这种发现的差异初步表明，与FE-2PEG相比，FE-4ZW具有更快的积累速率，从而表明FE-4ZW可能与细胞膜具有更强的相互作用，因此有可能作为更好的细胞造影剂。因此，我们设计了广泛的体外和/或体内实验来测量FE-4ZW作为细胞造影剂的能力。
图1. FE荧光团提供有效的第二近红外（NIR-II）荧光成像对比度水平的能力
由于FE-4ZW与细胞膜之间存在潜在的相互作用和/或亲和力，我们的方案不要求使用CPP，因此在获得荧光细胞方面更加简化和直接（图1D-F）。利用几种类型的细胞系，包括肝脏、巨噬细胞、干细胞和肿瘤细胞来评估 FE 荧光团系列。在FE-4ZW与不同细胞系共孵育的整个过程中，FE-4ZW标记细胞的NIR-II荧光强度随时间增加，其中在12小时时间点有足够的标记密度允许明亮的NIR-II成像（图1F和S5）。对于所有测试的细胞系，FE-4ZW的明亮NIR-II荧光信号允许在内化时明确地勾勒出细胞形状（图1E，F和S5）。
图2. FE-4ZW作为一种高性能细胞标记染料
相比之下，在 L-O2 细胞组中，当它们与 FE-2PEG 或 FE-2PEG2ZW 荧光团一起孵育时，获得了非常低的荧光强度。这些结果表明，分子结构在作为高效细胞标记生物技术的作用中起着重要作用（图2A，B）。FE-4ZW的细胞内光稳定性也是通过将标记的L-O2细胞置于连续激光照射下来确定的（图2C）。荧光信号仅在2小时的时间过程中以极慢的速率衰减。总的来说，FE-4ZW是一种理想的细胞成像剂，具有明亮的细胞内NIR-II荧光发射和优异的光稳定性。FE-4ZW的这种优越性能为非侵入性跟踪体内细胞命运奠定了基础。
在细胞中使用FE-4ZW孵育12小时后，用新鲜培养基替换含有未内化FE-4ZW的细胞培养基。将标记的细胞顺序培养长达 7 天，每天收集上清液并通过 NIR-II 检测器成像。所有收集的上清液均未观察到可检测到的 NIR-II 信号，而细胞本身表现出明亮的 NIR-II 荧光信号，这表明标记细胞中细胞内 FE-4ZW 染料的稳定内化（图 2E、F）。另一个补充需求是体内细胞追踪，即使在主要标记信号显示细胞增殖过程中耗尽后，也能充分检测增殖的细胞。即使细胞计数呈指数增长（经CCK8测定证实），稳定的NIR-II荧光信号仍可检测到长达6天（图2G-I）。上述结果表明，FE-4ZW在细胞中的标记和/或内化可以维持很长时间，从而为利用高对比度NIR-II荧光生物成像在细胞水平上监测复杂的生理过程提供了机会。
图3. 通过使用 FE-4ZW 进行第二次近红外 （NIR-II） 荧光成像来跟踪移植神经干细胞 （NSC） 的位置
通过用 FE-4ZW 预培养 NSC 来证明活体 NSC 跟踪，然后静脉注射标记的 NSC。根据既定方案，通过离心仔细收集FE-4ZW标记的发光NSC，随后静脉内移植到Balb / C小鼠模型的血液循环系统中（图3A）。NIR-II荧光信号在立即观察时提供了清晰的肺部轮廓，从而揭示了标记的NSC首先在肺部积聚。这一结果与之前关于间充质干细胞监测的报道一致。肺内FE-4ZW标记的NSC的NIR-II荧光信号随着时间的推移逐渐减少，并在72小时时间点后几乎消失。在整个实验过程中，肝脏中的NIR-II荧光信号逐渐增加。这些结果证实，静脉注射后移植的NSC在肺部初始积累后逐渐转运到肝脏（图3B-E）。通过跟踪NSCs进行纵向无创实时体内成像，可为临床NSC治疗的生理机制和障碍的检测提供便捷的细胞跟踪技术。
监测肿瘤细胞在体内的命运对于研究潜在的肿瘤转移至关重要，但目前的非侵入性策略未能实现这一目标。皮内注射FE-4ZW标记的4T1肿瘤细胞，并观察到肿瘤细胞（或细胞聚集簇）随着时间的推移沿着淋巴管迁移（图3F），从而最终接种在相邻的淋巴结中（图3G，H）。通过体外泄漏实验和细胞增殖实验来测试FE-4ZW的细胞内稳定性。结果表明，在细胞内化后，FE-4ZW可以稳定地存在于细胞区室中（图2D-I）。此外，体内NSC细胞追踪结果显示，FE-4ZW标记的NSCs在肺内停留了很长时间，并逐渐循环到肝脏。这表明内部化的FE-4ZW没有与NSC分离。如果FE-4ZW从细胞中分离出来，肺的轮廓将迅速消失（图3B，D）。图3F中沿淋巴管自由移动的荧光点的存在表明细胞聚集簇沿着淋巴管运输，而不是FE-4ZW染料自由移动。本文报道的方法可能适用于监测肿瘤细胞的命运和迁移途径，从而可以识别肿瘤转移的关键参数。
图4. FE-4ZW可用于淋巴通路的体内成像和跟踪脑肿瘤细胞循环
为证明 FE-4ZW 作为造影剂在体内跟踪 CSF 循环和跟踪 MLV 和颈部淋巴结中细胞迁移的潜力。图4A说明了证明FE-4ZW作为脑脊液追踪器潜力的实验过程。Cisterna Magna （CM） 的曝光过程、FE-4ZW 的CM 注射和获取 NIR-II 图像的过程均在 ISO 麻醉下进行。图4B显示了FE-4ZW在脑背侧分布的代表性时程图像，表明FE-4ZW可以通过完整的头皮进行CM输送来对脑脊液循环通路进行成像。之后，我们收集了脑组织，并对FE-4ZW在脑组织表面以不同姿势的分布进行了成像。图4C显示CM注射的FE-4ZW沿PVS分布和大脑中动脉周围的PVS轮廓被清晰地照亮（图4D）。在证明FE-4ZW 作为所需的 CSF 示踪剂后，我们通过 CM 注射 FE-4ZW 标记的 GL261 细胞对脑肿瘤细胞迁移进行了体内监测（图 5E）。注射FE-4ZW标记的GL261细胞后，我们监测了GL261脑肿瘤细胞的行进途径。对明确的MLV结构进行成像，表明CM注射的细胞沿着MLV随脑脊液循环而行进（图4F）。消失的MLV结构意味着注射的细胞具有时间依赖性迁移过程（图4F，G）。在细胞循环 2 小时后收集 MLV，并通过内部 NIR-II 荧光显微镜对 MLV 内细胞的分布进行成像。代表性图像显示，注射的细胞主要分布在覆盖横窦和嗅球的MLV内（图4H，I）。然后，我们去除宫颈皮肤，并在成像装置下暴露CLNs，在允许细胞循环2小时后，周围的荧光信号表明CLN（sCLNs和dCLNs）可能对中枢神经系统疾病（如脑肿瘤）具有重要功能（图4J）。使用NIR-II荧光显微镜来观察注射细胞在sCLNs和dCLNs中的详细分布。被明亮荧光点覆盖的 sCLN 和 dCLN 意味着GL261 细胞簇已迁移到 sCLN 和 dCLN 中（图4K）。FE-4ZW标记组的荧光面积大于PBS组，进一步证实了sCLNs和dCLNs充满了标记的GL261细胞（图4L）。体外细胞成像和体内细胞跟踪研究的结果证实，FE-4ZW可以作为细胞造影剂。FE-4ZW的优点包括：（1）充分保持光稳定性，能够满足重复的成像要求;（2）高效的细胞标记能力，无需使用CPP，如TAT，CPP的一种。
具有拴系两性离子泡沫铵末端基团的 NIR-II 荧光发射 S-D-A-D-S 荧光团提供了一种无需 CPP 即可高效标记活细胞的方法。引入的四性离子磺化铵末端基团不仅赋予FE-4ZW优异的水溶性，而且提高了与各类细胞共孵育时与细胞膜的亲和力。FE-4ZW用于体内监测移植细胞的命运和脑肿瘤细胞迁移到颈部淋巴结的命运。FE-4ZW染料在细胞中内化并保留在细胞中，基于形态学没有明显的细胞毒性。此外，NIR-II荧光染料FE-4ZW可对标记细胞进行长期监测和可视化。此外，尽管NIR-II荧光信号强度随着原代FE-4ZW标记细胞的增殖而降低，但增殖6 d后的NIR-II荧光信号强度仍可检测到。
干细胞疗法可以通过减少炎症和调节免疫系统来修复目标位置的受损细胞，因此评估施用的NSC的积累效率至关重要。得益于高NIR-II荧光信号强度和优异的细胞内化学/光稳定性，使用FE-4ZW对NSCs的转移和生物分布进行了非侵入性追踪。这是首次利用不含CPP的有机小分子NIR-II荧光发射荧光团，以监测小动物模型中静脉注射后干细胞的迁移过程。在肿瘤转移中，癌细胞可以从原发肿瘤中逃逸，与血液和/或淋巴管一起迁移，并在远处器官/组织中播种新的肿瘤。本文量身定制的荧光团还提供了一种潜在的方法，可以使用非侵入性途径在体内可视化此类转移过程的特定方面。
先前的报道表明，在花青NIR-I荧光发射荧光团上修饰两性离子基团可以降低荧光团与蛋白质之间的相互作用，从而赋予花青染料更快的肾脏排泄速度。NIR-II 发射荧光团 （FE-4ZW） 的两性离子 S-D-A-D-S 结构促进了对细胞膜的高亲和力和相互作用。所设计的两性离子泡沫铵基团是FE-4ZW高内化能力的确定因素。FE-4ZW的标记效率高于其他FE染料（FE-2PEG、FE-2PEG2ZW和FE-4SO3Na）。FE-4ZW的细胞摄取机制包括能量依赖性内吞作用和能量依赖性被动转运。通过培养温度的降低和额外的内吞抑制剂观察到的明显的荧光信号强度消耗表明，内吞作用是FE-4ZW的少数潜在摄取途径之一。另一种摄取机制可以用以下几点来解释：（1）FE-2PEG未能内化为固定细胞，甚至无法将工作浓度提高到50μM;（2）在低温条件下或在抑制剂存在下进行细胞摄取不能分别完全抑制FE-4ZW的摄取。此外，使用TPGS/FE-4ZW混合物后，FE-4ZW的肝脏和脾脏积累减少。FE-4ZW为提高体内细胞追踪的成像质量提供了令人兴奋的可能性。为了解决一些未满足的实际需求，可以考虑以下改进：（1）由于与波长相关的穿透深度，将FE-4ZW的发射波长扩展到NIR-IIb可以进一步提高成像质量;（2）简化FE-4ZW的合成工艺，使其更适合临床应用。总体而言，NIR-II 荧光发射荧光团 FE-4ZW 为高分辨率非侵入性跟踪移植细胞提供了一种便捷的策略，并为在 NIR-II窗口中生产发射荧光信号的高性能细胞成像剂提供了合理的设计策略。
参考文献
Sun B, Ma R, Wang X, et al. A high‐performance cell‐labeling NIR‐II dye for in vivo cell tracking[J]. View, 2024, 5(2): 20230097.
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