1064nm 激发用于光热免疫测定的 NIR-II 吸收 TMB 衍生物

本文要点：在NIR-II区域表现出强吸收性的材料对基于光热转换的成像、诊断和治疗具有吸引力，因为该区域具有更好的热效应和更少的水吸收。3,3′，5,5′-四甲基联苯胺 （TMB） 是 ELISA 中的典型底物，因其氧化产物 （oxTMB） 在 NIR 区域具有光热活性，因此已在光热免疫测定中进行了探索。然而，它在 1064 nm（光热研究中最常用的激光波长）处的吸收并不明显，因此限制了灵敏度的测定。在这里，我们提出了TMB（3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基联苯胺，2-OCH3）在1064 nm激发光热免疫测定中具有更高的NIR-II吸收。由于供电子基团可以帮助减少分子的能隙（这里是 -CH3→ -OCH3），2-OCH3的氧化产物与oxTMB相比，表现出显著的红移吸收，导致在1064 nm处的吸收系数高出两倍以上。因此，2-OCH3在光热免疫测定 （PTIA） 中显示出比 TMB 更高的灵敏度，前列腺特异性抗原 （PSA） 的检测限 （LOD） 为 0.1 ng/mL。2-OCH3的可行性通过分析 61 份血清样本中的 PSA，进一步验证了基于 PTIA 的诊断。考虑到其优异的光热性能，2-OCH3可以探索广泛的光热应用。

动物活体成像系统

光热效应是指将光能转化为热能，表现出这种效应的材料在生物检测中得到了广泛的应用。3′3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）是ELISA中占主导地位的显色底物，已广泛应用于各种分析检测过程，其中 TMB在HRP催化剂（HRP-抗体偶联物）存在下被 H2O2氧化。本文提出了一种新的TMB衍生物，该衍生物增强了其单电子氧化产物的NIR-II吸收，用于改进光热免疫测定（PTIA）。具体而言，将供电子甲氧基团引入TMB框架的3-、3'-、5-和5'-位置，导致最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）之间的带隙变窄，从而产生红移吸收。两种候选衍生物，即3,3′，5,5′-四甲氧基联苯胺（2-OCH3）和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基联苯胺（4-OCH3），进行了测试。在 NIR-II 窗口内的 1064 nm 处，2-OCH3的单电子氧化产物， 2-OCH3·+，具有出色的光热转换效率 （η = 28.8%） 和 1.48 × 104M-1cm-1的摩尔吸收系数 （ε）,表现出优于 TMB 的性能。当应用于 PTIA 时，2-OCH3前列腺特异性抗原（PSA）的检测限（LOD）为0.1 ng/mL，是TMB（LOD，0.27 ng/mL）的2.7倍。2-OCH3 的精度基于 PTIA 的 61 份血清样本也得到了验证，显示了其在医学诊断中的潜力。

图1. 具有增强 NIR-II 吸收的 TMB 衍生物的设计和验证

为了提高1064nm处的吸光度，需要吸收的红移。众所周知，电子供体基团的引入有助于减小最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）之间的能隙，从而产生红移吸收和发射。首先利用理论计算来预测原始衬底（TMB及其衍生物）及其单电子氧化产物（图1A）的光谱特性。合成两种TMB衍生物，即3,3′，5,5′-四甲氧基联苯胺（2-OCH3）和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基联苯胺（4-OCH3）。随后，TMB和合成衍生物的实验结果证实了上述光谱学预测，即观察到2-OCH的明显红移吸收3和 4-OCH3在TMB上（图1D）。将反应置于 H2O2-HRP氧化后，相应氧化产物的吸收也大大红移（图1E）。例如，2-OCH的摩尔消光系数3(ε = 1.48 × 104M-1cm-1）在1064 nm处比TMB高两倍以上（ε = 6.06 × 103M-1cm-1）。因此，这种简单的结构修饰有效地增强了TMB在1064 nm处的吸收，从而在理论上改善了衍生物的光热响应。

图2. 基底的光热性能

接下来，用红外热像仪进行评估TMB，2-OCH3和 4-OCH3（之后 H 2O2-HRP氧化）的光热能力。为了实现这样的目标，在功率密度为1.2 W/cm2 的  1064 nm 激光器下暴露50秒。如图 2A所示，2-OCH3和 4-OCH3温度分别上升了21.7和19.3 °C，大大高于TMB（11.7 °C）。详细测试表明，在 1064 nm 处，2-OCH3的光热响应较强可归因于其高光热转换效率（η=28.8%，图2B，C）和摩尔消光系数（ε = 1.48 × 104M-1cm-1）。在连续五个激光开/关循环中，2-OCH3相对标准差 （RSD） 为 1.6%（图 2E），也比 TMB （RSD = 3.58%，图2D）更稳定。当比较信噪比时，2-OCH3在 TMB 和 4-OCH3中均表现出最佳性能 (图2)此外，2-OCH3的氧化在不同量的HRP存在下具有高度的可重复性，表明2-OCH3是免疫测定的良好底物。因此，2-OCH3被选中进行进一步调查。

图3. 2-OCH3 氧化产物在 HRP-H2O2 系统中的表征

2-OC3的氧化产物可以以两种形式呈现：单电子氧化产物（2-OCH3·+），也称为电荷转移复合物 （CTC） 和二亚胺二酰胺二分化 （2-OCH3+2).先前的研究表明，如果受体的电子亲和力（ΔE）超过了供体（S）的HUMO和受体（S）的LUMO之间的能隙（ΔE）2+），电荷转移将导致CTC的形成（图3A）。证实了2-OCH3的氧化产物在 HRP-H2O2系统中确实是 2-OCH3·+，在NIR-II区域表现出很强的吸收性，以改善光热应用。

图4. 2-OCH3 基于 PSA 检测的 PTIA

在2-OCH3氧化产物具有优异光热性能的基础上，评价了其在PTIA中的可行性。为了实现这一目标，PSA被用作模型分析物，PTIA的构建是通过在商业PSA试剂盒中用2-OCH3简单地取代TMB来实现的（图4A）。在PSA检测之前，研究了一系列参数，包括pH、H2O2浓度、样品体积、激光照射时间和缓冲液，以获得最佳光热响应。在最佳条件下，温度响应与PSA浓度在0.31−20 ng/mL范围内呈线性关系（图4B）。建立的相关方程为y=1.19x+3.47，相关系数为0.995（图4B）。与TMB（LOD，0.27 ng/mL）相比，在PTIA中使用2-OCH3（LOD：0.1 ng/mL）显示出2.7倍的灵敏度提高，从而证实了2-OCH3在PTIA的优越性能。与ELISA类似，基于2-OCH3的PTIA也表现出优异的特异性（图4C）和长期稳定性。

为了探索基于2-OCH3的PTIA的普遍性，还选择CEA、IgG和GPC-3作为分析物进行额外验证。与PSA测定类似，通过用2-OCH3取代TMB来调整用于这些分析物的市售试剂盒。、此外，对于所有这些分析物，观察到比TMB底物更高的灵敏度。这些结果不仅证明了2-OCH3优越的光热效率，而且揭示了基于2-OCH3的PTIA在临床诊断中的多功能性。

图5. 用基于 PTIA 的 2-OCH3 检测血清样本中的人 PSA

人类血清中PSA的检测。通过检测临床血清样本中的PSA，验证了基于2-OCH3的PTIA的诊断能力。为了实现这一目标，共收集了61份血清样本，其中20份来自健康个体，41份来自诊断为前列腺癌症的患者（表S6），并进行了PTIA和ELISA检测。如图5A所示，从两种方法获得的结果之间存在高度相关性。受试者操作特征（ROC）分析显示，PTIA（0.987）的曲线下面积（AUC）略好于ELISA（0.963），表明PTIA对前列腺癌症诊断具有良好的准确性（图5B）。根据ROC曲线，ELISA和PTIA的诊断阈值分别为3.3 ng/mL和2.58 ng/mL。混淆矩阵分析表明，PTIA的特异性为100%，灵敏度为92.7%（图5D），而ELISA的特异性和灵敏度分别为100%和85.4%（图5C）。这些结果证实了基于2-OCH3的PTIA在临床诊断中的潜力。此外，在3周内对同一样品进行重复分析后，发现RSD为8.1%，表明基于2-OCH3的PTIA具有良好的稳健性。

本研究提出了一种新的光热试剂（2-OCH3）基于用甲氧基取代TMB的甲基。与TMB相比，2-OCH3的单电子氧化产物表现出更高的摩尔消光系数 （ε = 1.48 × 104M-1cm-1），从而产生高效的光热转换效率（η = 28.8%）。2-OCH3是TMB的衍生物，可直接替代目前ELISA试剂盒中的TMB进行光热免疫测定。在 PTIA 应用中，2-OCH3在1064 nm激光器的刺激下，表现出比TMB更高的信噪比和灵敏度。由于信号读出的简单性和临床应用潜力，2-OCH3可作为基于 PTIA 的诊断的极好基材。考虑到2-OCH3出色的光热性能TMB，在光热疗法中2-OCH3的应用前景广阔，也可以预期成像和其他相关应用。

参考文献

Henglin Liu, Xiao Zhang, Xianming Li, and Peng Wu. NIR-II-Absorbing TMB Derivative for 1064 nm-Excited Photothermal Immunoassay. Analytical Chemistry 2024 96 (14), 5633-5639