纳米颗粒 | 基于高效能量转移探针的NIR-II荧光侧向层析免疫传感器用于肿瘤生物标志物即时检测

本文要点：荧光侧向层析免疫测定（LFA）因其简单、灵敏和灵活而成为快速筛选各种生物标志物的有力工具。值得注意的是，荧光探针主要决定了LFA的分析性能。由于发射和激发波长位于可见光区域，因此大多数荧光团不可避免地受到光散射和背景自发荧光的影响。本文报道了一种基于第二种近红外（NIR-II）荧光探头的新型LFA传感器，具有优异的抗干扰能力。设计的NIR-II探头是Nd3+和 Yb3+掺杂稀土纳米颗粒（RENPs），以Nd3+掺杂作为能量供体和 Yb3+作为能量受体，供体-受体能量转移（ET）效率达到80.7%。同时，依靠聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球对RENPs的方便有效的包封策略，获得了表面功能化的NIR-II探针（RE@PLGA），用于后续生物偶联。得益于NIR-II探针的光学优势，该近红外LFA在检测肝细胞癌（HCC）的重要生物标志物α胎蛋白（AFP）方面显示出良好的线性关系，范围为7 ng/mL至200 ng/mL。检出限（LOD）低至3.0 ng/mL，比临床临界值低8.3倍。基于这种高效RENPs探针的LFA传感器有望为生物样品中各种生物标志物的高灵敏度检测提供新的机会。

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方案 1.基于高效NIR-II探头的LFA传感器设计方案

在这项工作中，作者设计并合成了一种基于Nd3+和 Yb3+的高效NIR-II探针REMPs，以 Nd3+作为能量供体和 Yb3+作为能量受体。由于敏化剂离子 Nd3+的高能量转移过程到发射极离子 Yb3+，该RENPs探针表现出较高的ET效率和背景荧光的抗干扰能力。同时，依靠PLGA微球对RENPs的方便高效的包封作用，获得了表面功能化的NIR-II探针（RE@PLGA），用于后续的生物偶联。通过使用RE@PLGA作为荧光报告基因，开发了一种新型NIR-II LFA传感器来检测α胎蛋白（AFP），AFP是诊断肝细胞癌（HCC）的一种极其重要的生物标志物[24]。所提出的NIR-II LFA具有灵敏度高、可靠性好、响应快等优点。它有望成为POCT的强大技术，它将进一步体现其在初级保健、快速诊断和大规模筛查方面的价值。

图 1.RENPs探针的内在ET机制（Yb@Y-Nd70%@Y）

先前的研究表明，它在敏化剂离子Nd3+和发射极离子 Yb3+之间具有很高的能量转移效率（高达70%）。本文合成了 Nd3+和 Yb3+掺杂的RENPs进行了一些修改。RENPs的结构示意图呈现明显的核壳结构，其结构成分为NaYbF4@NaYF4：Nd70%@ NaYF4（表示为Yb@Y-Nd70%@Y）（图 1a）。特别是NaYbF4NPs是唯一的活化剂，位于内核，可以快速接收来自Nd3+离子的能量。由于 Nd3+离子的吸光系数高于Yb3+离子，它作为有效的光吸收剂和敏化剂，其掺杂浓度被调节在很大的范围内（从30%到95%）。为避免掺杂浓度过高而产生严重的交叉松弛效应，最佳掺杂浓度为Nd3+离子（Nd70%）分布在次级外层（NaYF4：Nd70%）。此外，NaYF4在最外层涂覆，以保护内部敏化剂和活化剂免受表面淬火。

基于NIR-II探针的LFA原理解释如下：RENPs（Yb@Y-Nd70%@Y）探针具有高ET效率和优越的光学性能，能够避免生物样品的背景干扰，对于实现肿瘤生物标志物的高灵敏度和准确检测至关重要。从方案1 开始，将 AFP 包被抗体 （AFP-09） 设置为测试线（T 线）和 IgG 作为对照线（C 线）分别喷洒在硝酸纤维素 （NC） 膜上。将含有AFP和RE@PLGA-Ab溶液的生物样品预混，然后加入检测卡的样品孔中，然后加入样品缓冲液。样品液体沿试纸飞到NC膜上，形成的免疫复合物（RE@PLGA-Ab-AFP-10）与AFP包被抗体特异性反应，在T线形成夹心结构（RE@PLGA-Ab-AFP-AFP09）。多余的 RE@PLGA-Ab 复合物与固定在 C 线上的 IgG 非特异性结合，作为质量控制信号。在808 nm激发光下，NIR-II荧光免疫分析仪分别记录了T线和C线产生的NIR-II荧光发射信号（980 nm）。在最佳条件下，980 nm处的AFP浓度和FL强度比值（T/C）呈现出良好的线性关系，为生物样品中AFP的定量检测提供了一种快速、灵敏、准确的方法。

图2.基于高效NIR-II荧光探头的LFA传感器的分析性能

在最佳条件下，开发了一种基于高效NIR-II探头的新型LFA传感器，用于AFP的测定。随着AFP浓度的增加，荧光强度比（T/C）逐渐增加。AFP 浓度和 T/C 值在 7.0 ng/mL 至 200 ng/mL （y = 0.0023x + 0.0413， R = 0.9923） 之间显示出良好的线性关系（图2a-2c）。检测限（LOD）估计为3.0 ng/mL，比临床临界值（25 ng/mL）低8.3倍（图2 d）。此外，与先前报道的检测方法相比，所提出的NIR-II LFA也表现出良好的灵敏度和相对较宽的线性检测范围。

通过分别添加四种肿瘤生物标志物（AFP、CEA、PSA 和 CA50）来估计 NIR-II LFA 的特异性。计算交叉反应性 （CR） 以评估该方法的特异性。当在制备的NIR-II LFA试纸中加入高浓度的肿瘤生物标志物（200 ng/mL）时，只有AFP的T/C值较高（0.534）。其他肿瘤生物标志物（CEA、PSA、CA50）的T/C值均低于0.02，相应的CR也不超过1.5%。结果表明，这些干扰物质对NIR-II LFA的检测过程影响不大，表现出优异的特异性（图2e）。由于抗体的选择性识别能力主要决定了方法的特异性，也证明了所制备的NIR-II探针（RE@PLGA-Ab）具有良好的选择性。

采用化学发光免疫测定法（CLIA）作为对照，进一步评估NIR-II LFA的有效性和可靠性。分别通过罗氏 CLIA（线性范围：0.5-1000 ng/mL）、商业 AFP 试剂盒（线性范围：10-200 ng/mL，可见荧光检测）和拟议的 NIR-II LFA 方法（线性范围：7.0-200 ng/mL）测定的 12 份血清样品。首先通过SPSS软件对样本测试结果进行统计分析。结果表明，无论是NIR-II LFA和CLIA还是VIS LFA和CLIA均无显著差异（P > 0.05），表明所开发的用于AFP检测的NIR-II LFA是可靠的。进一步对3种方法的试验结果进行了一致性分析。从图2f-g可以看出，VIS LFA与CLIA的相关系数（R）为0.9989，NIR-II LFA与CLIA的相关系数为0.9997。与VIS LFA相比，所开发的NIR-II LFA与CLIA的吻合性更好，表明所提出的基于高效NIR-II探头的LFA传感器在临床血清样本中AFP的定量测定中具有更优异的准确度和效度。

综上所述，我们开发了一种基于高效NIR-II荧光探针的新型LFA传感器，用于检测肿瘤生物标志物（AFP作为模型分析物）。所提出的RENPs探针具有三个独特的优势，为临床转化提供了广阔的前景。首先，制备成本低，制备过程可控，便于大规模生产。其次，敏化剂离子Nd3+和发射极离子 Yb3+在RENPs内部构建了一条能量转移高速公路，产生了优异的荧光效率。第三，PLGA微球的包封策略容易实现RENPs的表面修饰，有助于生物偶联;由于NIR-II探头具有优异的抗干扰能力和荧光特性，所提出的NIR-II LFA传感器能够实现临床血清样本中肿瘤生物标志物的无背景检测，具有良好的灵敏度和宽线性范围。该LFA传感器可作为POCT肿瘤生物标志物的早期诊断和大规模筛查的有力工具。

参考文献

Song, Z.; Hao, Q.; Li, B.; Yuan, Y.; Zhang, S.; Suo, Y.; Han, H.-H.; Cheng, Z., NIR-II fluorescence lateral flow immunosensor based on efficient energy transfer probe for point-of-care testing of tumor biomarkers. Chinese Chemical Letters 2024.