使用TEMPEST®液体处理器改进自动化高通量AlphaLISA®检测

AlphaLISA®是一种基于微珠相互接近的检测方法

尽管AlphaLISA®可以根据所研究的分析物采用各种配置，但分析原理始终涉及两个珠子相互作用以产生可测量的光信号。在此处描述的研究中，圣裘德儿童研究医院的研究人员利用AlphaLISA®技术筛选了一个包含大约 4,900 种化合物的库，目的是识别能够阻断专有目标蛋白与底物之间相互作用的单个分子。

在AlphaLISA®反应过程中，使用链霉亲和素包被的供体珠结合生物素化底物，使用抗His 包被的受体珠结合His标签的靶蛋白。然后用 680nm 的光激发供体珠子，使它们释放单线态氧分子。由于靶-底物结合，供体珠和受体珠非常接近，单线态氧分子与受体珠的反应导致波长为 610nm 的光发射。

相反，当目标-底物相互作用被化合物阻断时，珠子相距太远，单线态氧转移无法有效进行，且无法检测到610nm的光信号（见图2）。

TEMPEST® 再循环功能可防止由于AlphaLISA®珠子沉降引起的测定漂移

AlphaLISA®珠子因其沉降倾向而为人所知，这种特性会导致随时间而显著的实验漂移和信号完全丢失。解决此问题的一种方法是在AlphaLISA®测定期间用磁力搅拌器不断混合供体和受体珠溶液，但这种方法并不总是能保证有效混合（例如，在磁棒未对准的情况下）；如果装有珠子的容器意外翻倒，这也可能导致有价值的试剂丢失。

TEMPEST®可以选择以预设间隔重新充注仪器芯片，再循环AlphaLISA®珠试剂，以在整个检测过程中保持均匀的悬浮液。充注芯片会将珠子返回到试剂容器中，不仅在容器内混合溶液，而且还确保芯片中的试剂保持活性（见图3）。通过将再循环间隔设置为1分钟，圣裘德儿童研究医院的研究人员消除了微珠沉降问题，而不会因操作错误而导致试剂损失的风险。

灵活性的增强改进了现有的AlphaLISA®工作流程

许多自动化的高通量检测由于试剂输入能力低而导致时间线延长。例如，使用单一的传统分液器分配AlphaLISA®测定的每个单独成分，需要在实验期间多次清洗管道，增加了大量的延迟和手动步骤，无法实现自动化。尽管通过在同一检测中组合多个分液器可以缩短时间，并使检测完全自动化，但空间的可用性往往使其不切实际。

TEMPEST®液体处理仪能够从一个芯片中分配多达12种试剂，大大增强了测定的灵活性。能够用一台仪器将两种微珠试剂溶液分配到同一个检测板上，使圣裘德儿童研究医院的研究人员能够简化AlphaLISA®工作流程，并设计出以前只限于单一试剂输入的检测方法（见图5）。

在使用TEMPEST®对所有AlphaLISA®微珠添加的4900个化合物库进行筛选后，圣裘德儿童研究医院的研究人员以多种方式评估了筛选数据的质量。使用z'因子作为测定窗口和每个控制孔内的变异性的综合衡量标准，他们发现AlphaLISA®测定可靠地产生z'因子，高于设定的截止值（0.5），并且在整个筛选过程中表现出板与板之间的一致性，没有随着时间的推移出现重大变化（见图6）。

支持这一发现的还有，很明显，阳性和阴性对照之间没有重叠，而且各孔板的对照值变化很小。这使我们有信心识别出18种化学化合物，并逐步进行剂量反应测试，其中2 1种化合物（IC50 < 1µM)目前正在进行进一步研究。

圣裘德儿童研究医院的研究人员证明了TEMPEST®是AlphaLISA®的一项强大技术，展示了它与其他基于磁珠的高通量筛选的潜力。TEMPEST的很多附加产品特性增强了其再循环功能、低死体积和仪器的灵活性，而所有这些特性都支持现有技术的改进，增加了新兴测定技术的范围。