使用 TEMPEST® 微流体分液系统自动处理 AlphaLISA® 试剂

介绍

药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 研究在药物发现和开发过程中发挥着关键作用。这些研究通常需要从具有高灵敏度和广泛分析范围的大量样品中表征药物和生物标志物的浓度。

AlphaLISA® 技术（PerkinElmer, Inc., Waltham, MA）是传统固相 ELISA 检测的均相免洗替代品，可用于血浆和血清样品中的生物标志物检测。

在 AlphaLISA 检测中，使用生物素化抗体和抗分析物偶联的受体珠来捕获目标分析物。生物素化抗体与链霉亲和素包被的供体珠结合。当样品中存在分析物时，供体珠和受体珠会聚在一起。激发后，供体珠内的光敏剂将环境氧转化为激发单线态。单线态氧扩散到200 nm 以在受体珠中产生化学发光反应，从而导致光发射。光量与样品中存在的分析物的量成正比，并且可以通过对照标准曲线对测定进行量化。

与传统 ELISA 相比，AlphaLISA 工作流程已被证明可提供更低的检测限、更高的测定精度和更宽的动态范围，同时在测量血浆样品中胰岛素的样品时体积减少 5 倍。该技术已应用于支持高通量生物分析的自动化过程，在 6 小时内可处理超过 10,000 个数据点。

与基于电磁阀的分液仪器相比，TEMPEST® 微流体分液仪器将 AlphaLISA 试剂添加步骤自动化，从而使试剂死体积从 30-65 毫升减少 6 倍至 5-10 毫升，同时在自动化的工作流程中保持分析性能。

材料和方法

如前所述制备生物素化抗体和抗分析物偶联的受体珠和测定缓冲液。

在 384 孔板 (Optiplates, PerkinElmer) 中进行该测定。在该测定中，校准品和样品一式两份。通过从 96 孔样品板转移到 384 孔酶联板，将测试样品 (2 μL) 和标准品添加到反应孔中。

使用 TEMPEST 或 FlexDropTM (PerkinElmer) 自动分液器，将 15 μL的 预混合抗体偶联受体珠和置于测定缓冲液中的生物素化抗体添加到反应孔中。

将酶联板盖上盖子并在室温 (RT) 下培养60 分钟。在培养结束时，使用 TEMPEST 或FlexDrop 分液器添加置于测定缓冲液 (30 μL) 中的链霉亲和素供体珠。 

将酶联板再次盖上盖子并在室温下培养30分钟。此后立即使用 EnVision® 读板器 (PerkinElmer) 检测酶联板。

结果

通过AlphaLISA自动检测系统处理736个样品，连续两天进行两次单独的测定。第一天的使用两台FlexDrop装置处理样品，将抗体和珠子分配到酶联板上。第2天使用TEMPEST来处理样品和分配试剂，并对所得的浓度值进行比较（图3）。得到的R2值为0.9741，平均回收率为101%。

第二个实验的目的是为了判断使用TEMPEST分配试剂检测方法的稳定性。使用50 pM的样品处理了20块微孔板。微孔板测试后CVs小于5%，20块微孔板双重测定的平均CVs小于3%（图4）。

讨论

AlphaLISA免疫测定的同质免洗特性有利于实施高通量的自动化工作流程；然而，在扩大流程以支持大规模PK/PD研究中的生物标志物检测需求时，必须考虑试剂的成本。

我们设计了一个集成的机器人工作站，在6小时内处理多达25个384孔板。为了满足所需的检测灵活性，最初的系统设计使用了两台FlexDrop仪器来分配AlphaLISA试剂。虽然这个系统设计能够提供所需的产量，但FlexDrop分配器在充注步骤中消耗了多达50毫升的试剂，导致每块微孔板的试剂成本大幅增加。

TEMPEST仪器采用的微流控隔膜泵技术使AlphaLISA试剂的充注量减少了3-5倍（图5），同时保持了PK/PD研究所需的检测性能和重复性。

此外，TEMPEST能够从96个喷嘴中分配多达12种试剂，这使得一台TEMPEST仪器可以取代两台FlexDrop仪器，降低了系统硬件的复杂性。最后，TEMPEST增加了容量，可以选择运行多达8种不同的测定，而其他分配仪器只能运行6种测定。