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利用 µPULSE®-TFF 系统的过滤透析功能快速进行实验室规模的蛋白质重折叠实验

Formulatrix China

2023/01/10 16:20

阅读：23

摘要

在大肠杆菌中生产重组蛋白时的困难之一是作为包涵体的错误折叠分子的积累，而这需要溶解和重折叠，否则就会失败。化学重折叠通常是通过某种形式的缓冲液置换去除变性/增溶剂来实现的。我们比较了使用 µPULSE TFF 系统的缓冲液置换与传统平衡透析来进行重组 α-淀粉酶的重折叠。µPULSE 提供了一些选项来定制过程，改变了缓冲液置换的速度和柔和度，从而对重折叠实验产生影响。在最佳条件下，µPULSE上的重折叠速度比平衡透析快七倍，而且不会影响重组蛋白的产量或质量。此外，使用 µPULSE 重折叠的样品表现出约 8% 的比活，这表明新方法具有类似（如果比活不大于8%的话）的重折叠能力。由此我们得出结论，使用 µPULSE 的受控缓冲液置换是一种更快的蛋白质重折叠方法，而且该方法可以优化为与平衡透析一样的温和。

介绍

重组蛋白在大肠杆菌中的过度表达，尤其是真核来源的重组蛋白，通常会导致形成不溶性和无活性的包涵体 (IB)。重折叠这些包涵体是为了获得具有生物活性蛋白质的最后努力。我们使用变性剂对包涵体进行溶解，然后逐渐将变性剂去除。当变性剂从溶液中去除时，蛋白质会重折叠。

所有重折叠方法都是基于缓冲液置换去除变性剂的原理。传统来说我们使用平衡透析来完成蛋白质重折叠，通过浓度梯度去除变性剂。平衡透析虽然温和，但是过程缓慢，必须每隔一段时间手动更换缓冲液。此外，使用平衡透析无法有效控制缓冲液置换。而且，我们通过稀释进行复性需要大型复性容器、较大的缓冲液体积 (50-100X) 以及随后的样品浓缩，这些因素使其成为一种高成本、长时间和多人工的方法。蛋白质重折叠也可以使用柱色谱法完成，这种方法相对较快，但由于需要精心优化，因此需要大量人工。最近，一种涉及使用微流体稀释样品的方法已被证明是非常有效的，但它只能处理微升的体积，不能用于制备目的（综述于1）。

另一种有效的缓冲液置换方法是切向流过滤 (TFF)，它快速且可定制，可用于控制变性剂的去除2。然而，传统的 TFF 系统体积庞大，截留体积高达数十至数百毫升。因而占地面积小且截留体积较低的 TFF 系统将是实验室规模应用的理想选择。在这里，我们使用 µPULSE-TFF 系统通过缓冲液置换演示了 α-淀粉酶的重折叠。

µPULSE-TFF系统

µPULSE 是一款完全自动化的无需看守的设备，专门服务于实验室规模的过滤和浓缩。它使用的是 50 mL 的样品管和一次性过滤芯片，这样易于保持设备清洁并防止交叉污染。专有的隔膜泵是过滤芯片的组成部分，实现了 0.65 mL 的截留体积和高达 100% 的截留回收率。

图1.µPULSE

图2.过滤芯片

在传统的 TFF 系统中，通过连续添加缓冲液来补充因渗滤而损失的溶液体积来实现缓冲液置换。µPULSE通过在不连续的操作步骤中自动将缓冲液添加到样品中来实现缓冲液置换。在置换结束时通过渗滤去除的分子浓度 C 可表示为

，其中 C0 是起始浓度，V0 是起始体积，Vstep 是步骤体积。假设在没有严重污染的情况下去除明显低于膜的 MWCO 的分子，简化该表达式（有关更详细的讨论，请参见3）。显然，为了最小化分子浓度 C，最好使步骤数 n 最大化，同时保持比率（V0-Vstep）/V0最小。换而言之，为了以最小的置换缓冲溶液体积实现最高置换，理想状态是使步骤数最大化的同时保持步骤体积尽可能小。

过滤速度和膜表面的受力由平均跨膜压力决定，

，其中 Pfeed 是进液压力，Pretentate 是截留物离开膜的压力（假设渗滤物侧没有背压）。这些各自的压力在 µPULSE 上指定为隔膜压力 (DP) 和回流阀压力 (RVP)。 TMP 越低，过程越温和，然而速度也会越慢。

材料和方法

大肠杆菌 BL21-CodonPlus (DE3)-RIL 感受态细胞用重组载体 pET21-淀粉酶转化并培养以产生重组 α-淀粉酶。超声处理细胞裂解后，通过在 12000 g 下离心，将含有 α-淀粉酶的 IBs 从可溶性部分中分离出来。将 IBs 重新悬浮在混有 1% Triton X-100 的 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 中，并在冰上培养 2 小时，间歇混合。接着将样品以 12000 g 离心并用 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 洗涤。然后将纯化的 IBs 溶解在含有 8 M 尿素和 10% 甘油的 50 mL 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 中。将所得溶液等分到 10 mL 样品（每个样品 800 µg 淀粉酶）中，使用平衡透析和 µPULSE 系统同时进行蛋白质重折叠。

为了使用平衡透析进行重折叠，我们将样品装入透析袋 (MWCO 10 kDa) 中并浸入含有 6 M 尿素的 100 mL 重折叠缓冲液中。每三个小时要将缓冲液置换为含有 4 M、2 M、1 M 和 0 M 尿素的缓冲液。重复 0 M 尿素步骤，过夜培养（13 小时）。

µPULSE 的自动缓冲液置换向导用于从变性 IBs 中连续去除尿素。对 DP 和 RVP（因此称为 TMP）的不同组合进行了重折叠测试（表 1）。无论 TMP 是多少，缓冲液置换都分 67 个步骤进行，同时保持步骤体积为 0.75 mL。

表 1.在 µPulse 系统上测试蛋白质重折叠的压力

结果与讨论

蛋白质重折叠时的主要目标之一是防止在去除变性剂时由于聚集体而导致样品损失。在这项研究中，在使用任何一种方法对任何样品进行重折叠的过程中均未观察到聚集体形成。使用 Bradford 测定的蛋白质估算显示所有回收样品中的蛋白质含量相等，表明样品回收率约为 100%，如图 3 所示。

使用平衡透析法重折叠需要 28 小时才能完成。使用 µPULSE 系统，我们可以在更短的时间内完成，同时完成快慢与压力有关。即使在最低 TMP = 5.5 PSI 时，与平衡透析相比，重折叠也可以在 7 小时内完成。在最高 TMP = 27.5 PSI（图 3）时，重折叠仅需 1.2 小时即可完成，这表明与平衡透析相比，µPULSE 系统的变性剂去除率要高得多。

图 3. 复性样品的复性时间、产量和比活性的比较

为了确定每种蛋白质重折叠技术的效率，我们比较了回收样品的比活性。通过平衡透析重折叠的样品表现出 48 U/mg 的比活性，而在最高压力下使用 µPULSE 系统重折叠的样品比活性要低约 42%。这可以解释为在这些压力下缓冲液突然置换和/或膜上的高剪切应力阻止分子实现正确的构象。在较低压力下处理的样品表现出较高的比活性，与压力成反比。有趣的是，样品在 TMP = 12.5 PSI 时，µPULSE 系统在四小时内完成重折叠的比活性比平衡透析在 28 小时内完成的比活性高约 8%（图 3），然而，当压力的进一步降低时，比活性并未变高。我们可以理解为，在 TMP = 12.5 PSI 时，µPULSE 系统已经实现了 100% 的重折叠效率，并且在这些设置下，该过程甚至比平衡透析更温和。

总结

µPULSE 是目前第一款真正的实验室规模 TFF 系统，而且压力可根据用户定制。根据我们对重组 α-淀粉酶进行的评估，这款系统能够用于蛋白质重折叠。高压会影响重折叠质量和重折叠样品的比活性。在最佳跨膜压力下，使用 µPULSE 通过缓冲液置换对 α-淀粉酶进行重折叠的速度要比使用平衡透析快 7 倍，同时前者的比活性会略高。而且我们可以施加压力使 µPULSE 系统进行蛋白质重折叠时和平衡透析一样温和。虽然这项工作是针对特定蛋白质完成的，但无论目标分子是什么，相同的原理可能适用于任何缓冲液置换方案。

1 - Singh, A., Upadhyay, V., Upadhyay, A.K. et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14, 41 (2015). https://doi.org/10.1186/s12934-015-0222-8

2 - Ryś, S., Muca, R., Kołodziej, M., Piątkowski, W., Dürauer, A., Jungbauer, A., & Antos, D. (2015). Design and optimization of protein refolding with crossflow ultrafiltration. Chemical Engineering Science, 130, 290–300. https://doi.org/10.1016/J.CES.2015.03.035

3 - Zeman, L. J. ,, A. L. Zydney, A.L. (1996). Microfiltration and Ultrafiltration - Principles and Applications. Marcel Dekker, New York.https://doi.org/10.1002/cite.330691022

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