使用 TEMPEST® 纳升级分液器将单细胞接种实验自动化

材料和方法

细胞培养和细胞接种

CHO-K1 细胞在 F-12K 培养基中贴壁培养。用胰蛋白酶-EDTA 收集细胞并重悬于培养基中。细胞两次通过 40 μm 细胞滤网，得到细胞悬浮液并将其稀释至 200 个细胞/mL。为了每孔接种一个细胞，使用 TEMPEST 或手持电动多通道移液器将 5 μL 细胞悬浮液转移到 384 孔板的每个孔中。

活性和接种效率

为了确定CHO-K1 细胞过夜恢复后的细胞活性，我们将其制备成细胞悬浮液（5000 个细胞/ml），并使用 TEMPEST 或电动移液器以 100μl/孔移液到 384 孔板中，最终实现 500 个细胞/孔的浓度。

微孔板成像

所有实验的微孔板均使用 Celígo 成像细胞仪进行成像，以获得细胞计数、实现单细胞接种和随后的克隆生长的可视化。我们使用荧光显微镜对细胞进行检测，而明场显微镜则被用于验证单细胞的存在和克隆生长。 图片拍摄于第 0 天和第 4 天。

结果和讨论

单细胞接种和细胞克隆生长

数据显示，在第 0 天，手动接种后 36% (3% CV) 的孔存有单细胞，而使用TEMPEST得到 32% (2% CV)的孔存有单细胞，过程中无统计学差异（P<0.01，n=3）（图 1A） )。 监测细胞培养进一步表明，在第 4 天，手动分配时克隆生长数据为 91%（6% CV），通过 TEMPEST 分配的数据为 91%（4% CV），过程中无统计学差异（P<0.01，n=3）（图 1B） 。在第 0 天和第 4 天，通过视觉跟踪监测克隆生长的比较，可以看到单细胞生长成菌落的板孔的扫描图（图 2）。 这表明 TEMPEST 在接种单细胞时与手动使用电动移液器的实验效果一样好。尽管这两者的分配机制非常不同，但 TEMPEST 不会影响长期细胞活性。

图 1. 使用电动移液器和 TEMPEST 系统在(A) 单细胞 CHO-K1 接种和 (B) 四天后细胞克隆生长 之间的比较。

图 2. Celígo 明场 (BF)、荧光 (FL) 和使用 TEMPEST 接种后的单个 CHO K1 细胞以及之后的细胞克隆生长的合并图像。

活性和接种效率

使用 TEMPEST 和电动移液器进行细胞接种时，细胞活性测量值分别为 97.4%（1.1% CV）和 98.98%（0.7% CV）。 两个实验中的细胞在接种后恢复程度相当。对整个微孔板的细胞计数进行比较表明，TEMPEST 具有更好的重现性，CV 为 10%，而电动移液器的 CV 为 17%（图 3）。 TEMPEST 细胞接种的较低方差体现在其分液体积精度和通过持续再循环维持均匀细胞悬浮液的能力。

手动与自动液体分配和板孔分析的对比

使用 TEMPEST 进行分配可将通量提高 25 倍，以此分配细胞并分析孔中是否存在单个细胞。数据显示使用 TEMPEST 系统从手动分配的 118 个样本/小时显着提高为 3008 个样本/小时（图 4）。 这一结果不足为奇，因为 TEMPEST 仅使用一个芯片便可在大约八分钟内以每孔 100 ul 的速度填充 384 孔板。 如果 TEMPEST 使用所有 12 个芯片进行相同的分配，则此分配时间会减少至大约一分钟。

图 3. 与电动移液器相比，使用 FORMULATRIX 公司的 TEMPEST 的细胞活性和接种变化。

图 4. 手动和自动分配的通量分析以及板孔分析。

总结

根据以上数据，我们可以得出结论，TEMPEST芯片中所使用的微型隔膜泵技术对于处理CHO K1细胞的稀悬液和浓悬液都足够温和，与传统的排气式移液器没有显着差异。TEMPEST 再循环功能使悬浮液保持均匀，加上仪器的高分液体积精度，与相同的移液器相比，可降低细胞接种差异。 TEMPEST 大大缩短了接种时间，将通量提高了 25 倍。 虽然这项工作是使用 CHO 细胞和 TEMPEST 进行的，但使用有着相同微隔膜技术的 MANTIS 仪器大概率可以通过其他细胞类型或以较低的通量实现类似的性能，因此这两款仪器都非常适合基于细胞的工作流程。