集菌仪，检验分析中的小技巧和小经验

2020-11-26 10:40

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资料摘要：

微生物实验室要不同于一般的实验室工程或净化工程。集菌仪主要应用于微生物学、生物医学、生物化学、动物实验、基因工程以及生物制品等研究使用的实验室统称为生物安全实验室，一般由主体实验室和辅助功能实验室组成。生物安全实验室保证人身安全、环境安全、废弃物安全和样本安全，能长期而安全的运行，同时还为需要实验室工作人员提供一个舒适，而良好的工作环境。微生物实验室设计　　微生物实验室由准备室、灭菌室、无菌室、限度室、阳性对照室、恒温培养室和观察室组成。也根据具体实验需求配有样品室、洗涤室、血清学室、鉴定分析室及废物处理室等。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。微生物实验室基本构架　　1、准备室(前处理室) 　　主要用于配制培养基和样品处理等。　　配套设施：冰箱、电炉、药品柜/试剂柜、存放器具或材料的专柜、加热搅拌器、离心机等。　　2、洗涤室　　准备室主要用于洗刷器皿等。集菌仪　　配套设施：加热器、蒸锅、洗刷器皿的器具、器具柜等。　　3、灭菌室　　主要用于培养基的灭菌和各种器具器材的灭菌。　　配套设施：高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设施。4、无菌室(接种室) 　　主要用于系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。　　基本建设：无菌室应设有内外两间，内间是无菌室外间室缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。小内间面积2*2.5，外间面积1*2，高以2.5m2以下为宜。　　配套设施：高温灭菌炉、超声波清洗器、高压水枪、快速灭菌炉、生物安全柜　　5、阳性对照室　　主要用于做阳性对照实验的接种、检测方法及培养基或其他试剂的适用性验证。　　配套设施：生物安全柜、集菌仪/限度仪、过滤器、混合器　　6、培养室　　应设有内外两间，內间为培养室、外室为缓冲室。房间容积不宜过大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2*4.4左右，外室在3.2*1.8左右，为满足微生物对温度的需求，需安装恒温恒湿机，内外室均应在中央安装紫外线灯。　　配套设施：培养架、摇床、各类培养箱　　7、观察室

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在本实验中，根据细菌分布的特点，提出以圆形区域为单位计算细菌总数的思路，使计算结果更接近真实值，从而提高了检测精度。 3.2.2 细菌大小的影响细菌大小对本实验的影响主要体现在镜检时，如果细菌太小，显微镜计数时不能将细菌从背景中分辨出来，我们的实验结果显示，不能分辨大肠杆菌和葡萄球菌，而较大的霉菌可以清晰地分辨。 3.2.3 检测时间进一步缩短细菌总数的经典检测方法是平板培养法，得到的结果精度高，但是它所用时间长，为了缩短检测时间，出现了微菌落法，将检测时间缩短为4 h左右〔3-5〕。本研究不对细菌进行培养，而是在膜上染色后直接用显微镜计数，大限度地缩短了检测时间，使整个检测时间在1 h左右。 4 结论本研究用集菌仪将菌液过滤后，取滤膜一部分进行染色、制片，然后在油镜下统计细菌个数。根据细菌在滤膜上的分布特点，提出将圆形区域作为统计单位，得到圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液浓度。实验结果表明，按照该方法得到的结果与平板培养法的结果无显著性差异。与平板培养法和微菌落法相比，该方法不需要细菌培养，检测时间只需要1 h左右，明显缩短了检测时间，是一种快速、有效的细菌总数检测方法

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式中：X表示待检菌液浓度（CFU/ml） A表示10个圆形区域内细菌总数 N表示滤网上小孔总数 V表示集菌时所用待检菌液体积（ml） 3 结果与讨论 3.1 实验结果按上述方法计算得到的结果与平板培养法得到的结果见表1。表1 两种方法得到的细菌总数 Table 1 Total bacteria number by two different methods 样本1样本2样本3样本4样本5样本6染色镜检 (cfu/ml）185168157165171166平板培养 (cfu/ml)176155165158183152 对表1中两组数据进行配对t检验，在α=0.05时，双尾检验结果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，说明两种方法得到的结果无显著性差异。 3.2 讨论 3.2.1 计算公式的改进用集菌仪对样本菌液进行过滤时，由于滤网挡板的作用，使得细菌不是均匀地分布在整个滤膜上，而是集中分布在滤网的小孔处，所以，计算细菌总数时，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分别为滤膜直径和视野直径），该公式是微菌落方法检测细菌总数中的常用计算公式。在本实验中，根据细菌

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2.2.3 染色集菌后取下滤膜，切下一部分放在载玻片上，进行染色、固定。染色的目的是增大细菌与背景的对比度，便于观察。 2.2.4 显微镜计数与计算菌液经集菌仪过滤后，细菌在滤膜上的分布见图2、图3，由图可以看出细菌分布具有以下两个特点：一是细菌集中在一个个的圆形区域内，这些圆形区域和挡板的小孔相对应；二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分布的这种特点，提出以圆形区域为单位进行计数，统计出圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液中细菌总数。具体步骤如下：随机选择10个圆形区域，在油镜下，调节焦距以获得较清晰的图像（见图4），统计每个圆形区域内的细菌个数，然后按公式(1)计算出菌液的浓度。 X=A10×N/V(1)图2 膜上细菌的区域分布 Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍) 图3 膜上细菌的区域间隔 Fig 3 The space among the distributing regions(100倍) 图4 膜上细菌染色后图像 Fig 4 Figure of bacteria after

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取得了的成果，但检测时间仍在4 h以上。本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法，具体步骤为：用集菌仪进行细菌收集→在膜上进行染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异，检测时间约1 h，是一种快速的细菌总数检测方法。 2 材料与方法 2.1 材料本研究中用的试验材料有集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），染色剂，生物显微镜（宁波永新光学股份有限公司），聚碳酸脂膜（直径47 mm）。 2.2 实验方法 2.2.1 准备工作卸下集菌仪的滤网（见图1），统计滤网上小孔总数，为计算菌液浓度做准备。另外，还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌，以防止过滤过程中引入外源细菌。 2.2.2 细菌收集取浓度的霉菌菌液300～500 ml，装在集菌仪上，集菌仪采用蠕动加压方式对菌液施加的压力，使菌液流过孔径为0.45 um的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌相对均匀地分布在滤膜上，而选用聚碳酸脂膜是因为这种膜具有良好的透光性，便于用显微镜观察。

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