人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株

                       人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株 百欧博伟生物

一、细胞简介

平台编号：Bio-54239

规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶

细胞信息：LOVO/5FU

细胞名称：人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株

用途：（STR（Lovo）鉴定）

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

注：本培养基是不直接添加氟尿嘧啶药物的。

二、细胞特性

1）来源：结直肠腺癌

2）形态：上皮样 贴壁生长

3）含量：>1x106  细胞数

4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5）用途：仅供科研使用。

三、细胞的运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

四、细胞接收后的处理方法

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。                      

五、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

（1）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

（2）完全培养基的配制：

①准备F12K培养基：优质胎牛血清，10%；双抗，1%；补充F12K基础培养基至所需体积。

②准备F12K含5-Fu完全培养基：优质胎牛血清，10%；双抗，1%；5-Fu：400~1065uM；补充F12K基础培养基至所需体积。

（3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

注意：

①细胞在传代和刚复苏时较为脆弱，中止液须为不含5-Fu的完全培养基，且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含5-Fu的完全培养基，待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加5-Fu。

②若细胞生长状态较为缓慢时，可适当降低5-Fu的浓度，或使用不含5-Fu的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的5-Fu浓度。

2、细胞培养：

（1）细胞复苏

①将恒温水浴锅中的水预热到37℃；

②准备一支15ml离心管，加入5mL含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；

③戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；

④将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；

⑤准备一个T25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4mL完全培养基；

⑥离心完成后弃去上清，用1mL完全培养基重悬细胞后，转入T25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

（2）细胞传代

①当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代；

②在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

③向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；

④向瓶内加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶），浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育3~5min；

⑤孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15mL离心管；

注意：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

a. 准备一个无菌的15mL离心管，加入2mL含10%FBS的完全培养基；

b.将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；

c.向之前消化的培养瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2mL含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。

⑥1000rpm离心5min；

⑦准备两个新的T25培养瓶，各加入4mL完全培养基；

⑧离心完成后，弃上清，用2mL完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T25培养瓶，每个培养瓶各1mL；

⑨水平放置培养瓶，震荡混匀后将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置。

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