ROSETTA(DE3)感受态细胞的应用！

                  ROSETTA(DE3)感受态细胞的应用！

一、背景

ROSETTA(DE3)感受态细胞采用进口Rosetta菌株，经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。Rosetta菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

二、特点

Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。

Rosetta(DE3)菌株含有pRARE质粒，能够提供AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA稀有密码子的tRNA，该质粒具有氯霉素抗性。

Rosetta(DE3)载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，能够提供更加“通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。

DE3是溶源性的λDE3,所以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。

三、操作步骤

1、取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。

2、待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。

3、42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

4、每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。

5、根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

四、应用

用于不同来源5-氨基乙酰丙酸合成酶的表达、酶学性质研究及其应用：

以外源基因的来源为出发点,利用来源不同的5-氨基乙酰丙酸合成酶之间的性质差异,以期筛选得到一种酶学性质优良并可在大肠杆菌体内高活性表达的酶,为ALA的高效生产奠定良好的基础。本文首先克隆并表达了4个分别来源于荚膜红细菌(R.capsulatus)、大豆根瘤菌(B.japonicum)、嗜酸柏拉红菌(R.acidophilus)、脱氮副球菌(P.denitrificans)的编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的hemA基因,并对上述hemA基因在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中的表达情况、重组酶的比活力和发酵情况等方面进行了比较。

结果表明,含有荚膜红细菌hemA基因的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET28a-RC.hemA表现出更好的合成ALA的潜力。通过亲和层析和凝胶过滤层析,制备得到重组酶RC-ALAS纯品。以放射形土壤杆菌(A.radiobacter zju-0121)和类球红细菌(R.sphaeroides)的hemA基因所表达的AR-ALAS和RS-ALAS为参照,研究了RC-ALAS的酶学性质。

结果表明,RC-ALAS酶活高达198.2U/mg,比AR-ALAS(151.1U/mg)和R.S.-ALAS(116.9U/mg)分别提高31.2%和69.5%；三者的最适温度均为37℃,最适pH均为7.5,其中,RC-ALAS对pH更为敏感,其余两者对温度更为敏感；金属离子、EDTA和SDS对三者酶活的影响基本一致；RC-ALAS的专一性常数(kcat/Km)S-CoA值为1.4989,高于AR-ALAS(0.7456)和RS-ALAS(1.1699)。

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