仓鼠肾成纤维细胞的培养操作与应用！

                   仓鼠肾成纤维细胞的培养操作与应用！

一、细胞简介

平台编号：bio-54259

拉丁属名：BHK-21 [C-13]

细胞名称：BHK-21 [C-13]仓鼠肾成纤维细胞

描述；1961年3月，I.A. Macpherson和M.G.P. Stoker从1日龄的仓鼠建立了BHK-21 (C-13)的亲本。随后84天连续培养，仅中断8天进行冻存，通过单细胞分离建立了13号克隆。这株细胞可用作转染宿主，用于表达包含选择及扩增标记的DNA(如Factor VIII,见ATCC CRL-8544)的载体。

动物种别；仓鼠

组织来源：正常肾

形态：成纤维细胞

培养基和添加剂：MEM培养基(GIBCO,货号41500034，添加NaHCO3 1.5g/L，Sodium Pyruvate 0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度。

供应限制：仅供研究之用。

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用

二、背景

BHK-21[C-13](仓鼠肾成纤维细胞)是I.A.Macpherson和M.G.P.Stoker从1日龄的仓鼠建立了BHK-21(C-13)的亲本。随后84天连续培养，仅中断8天进行冻存，通过单细胞分离建立了13号克隆。这株细胞可用作转染宿主，用于表达包含选择及扩增标记的DNA(如Factor VIII,见ATCC CRL-8544)的载体。

三、BHK-21[C-13](仓鼠肾成纤维细胞)细胞培养操作

1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

（2）加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

（3）按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

（4）将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

（1）细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

（2）4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

（3）将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

四、应用

用于工频磁场对中国仓鼠肺成纤维细胞自噬的诱导作用研究：

早期的研究表明极低频磁场可以诱导细胞分子水平的改变，如：细胞缝隙连接功能(GJIC)下降、细胞膜表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤坏死因子受体(TNFR)聚簇,以及基因和蛋白质表达谱发生改变等等。细胞自噬是机体重要的一种防御和保护机制,它大量降解并重复利用长寿命蛋白质、大分子物质以及细胞内受损的细胞器等,使细胞能够在饥饿环境下得以生存,细胞自噬和神经退行性疾病、衰老以及肿瘤相关。

方法：CHL细胞培养24小时,更换新鲜的培养基后进行50Hz0.4mT工频磁场暴露30分钟、2小时、6小时、12小时或者24小时,磁场暴露后通过以下三种方法检测细胞自噬水平：透射电镜观察细胞内空泡变化,激光共聚焦显微镜检测细胞内GFP-LC3定位自噬小体情况以及Western Blot实验检测细胞内LC3-Ⅱ表达。结果：透射电子显微镜观察到,工频磁场暴露30分钟和24小时诱导细胞内空泡增加；激光共聚焦显微镜观察到,在GFP-LC3高表达的CHL细胞内,工频磁场暴露不同时间点诱导GFP-LC3亮点标记的自噬小体增加(P>0.05),30分钟和24小时升高趋势较为明显；

Western Blot技术检测发现磁场暴露促进自噬的特异性标记蛋白LC3-Ⅱ表达增加(P>0.05),30分钟和24小时升高趋势较为明显；加入自噬小体与溶酶体融合的阻断剂氯喹后,磁场暴露30 min自噬流量增加(P<0.05)。结论：这些研究提示本实验条件下50Hz0.4mT工频磁场暴露可能诱导CHL细胞自噬效应。

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