人结肠腺癌肺转移细胞的应用！

                     人结肠腺癌肺转移细胞的应用！

一、背景

人结肠腺癌肺转移细胞是从一位72岁男性结肠癌患者的肺转移灶建立的可移植人类癌细胞株；肿瘤组织皮下接种于BALB/c裸鼠，并连续进行移植。在裸鼠身上的移植过程中，细胞株始终保持结肠癌的原始组织性状。

在无胸腺小鼠中传代23代后建立了T84细胞。T84细胞单层生长到饱和并在接触细胞间展现出紧密连接和桥粒，有很多关于多肽类激素和神经递质并维持定向电解质传输的受体。T84细胞展现了接触细胞中的紧密连接和桥粒，角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。

二、操作流程

1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

⑴弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

⑵加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

⑶按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

⑷将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于结直肠癌中EMT标志物的表达对预后的意义以及IGFBP-rP1在EMT和转移中的作用及机制研究：

肿瘤的转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程。近年来,越来越多的研究表明上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)在肿瘤的侵袭转移中发挥着重要的功能。

EMT是指上皮细胞受到外界信号刺激后,细胞形态转变为间质表型的生物学过程。在这一过程中,上皮细胞失去极性,失去细胞间的紧密黏附连接,上皮标志物表达下调或缺失,而逐渐获得间质细胞形态特征以及间质标志物表达,同时增强细胞的运动能力和迁移能力。

EMT过程中最显著的分子事件是E-cadherin表达降低,而N-cadherin,Vimentin和Fibronectin的表达增强,一些转录因子如Snail,Slug,Twist和Zeb1/2等通过直接或间接调控E-cadherin等EMT相关基因的表达,诱导EMT过程。

因此,检测这些与EMT相关的经典标志物在结直肠癌中的表达,明确其在结直肠癌预后中的作用,并试图从中遴选出关键的分子,以筛选具有高转移风险的患者群体,为患者的预后判断、转移预测、个体化治疗等方面提供有效的辅助支撑。EMT过程受众多重要的信号通路调控,包括TGF-β,RTK,Wnt,Notch,Hedgehog,Matrix和缺氧等。

其中TGF-β1是体外刺激肿瘤细胞构建EMT模型的经典因子,目前关于TGF-P信号通路参与调控EMT的报道颇为详尽,TGF-β与其受体结合后激活Smad2/3使其磷酸化,接着磷酸化的Smad2/3与Smad4结合入核,调节一系列与转移以及EMT相关靶基因的功能。另外TGF-β诱导EMT的过程还涉及与细胞运动和凋亡相关的一些其他信号通路,如PI3K/Akt通路、MAPK通路和Rho-like GTPase通路等。

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