人视网膜色素上皮细胞的培养与鉴定方法!
一、背景及概述
上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性,一面朝向身体表面或腔面,称游离面;一面向着深部的结缔组织,称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时,则影响机体的防御功能。
人视网膜色素上皮细胞分离自视网膜组织;视网膜色素上皮(RPE)位于脉络膜和光感受器细胞外节之间,是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道;主要是由单层色素上皮细胞所构成,排列十分规则。人视网膜色素上皮参与视黄醇循环,吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性,并分泌多种生长因子,帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。细胞呈多角形,细胞分为三部分,即顶部、体部和基底部。
人视网膜色素上皮细胞无再生能力,细胞死亡后不被替换,而是邻近的细胞向侧面滑动,以填补死亡细胞遗留下来的空间。人视网膜色素上皮位于脉络膜和光感受器细胞外节之间,是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道。人视网膜色素上皮参与视黄醇循环,吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性,并分泌多种生长因子,帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。
二、冻存和复苏
根据慢冻速融的细胞冻存原则,将原代或传代1-2次培养的人视网膜色素上皮细胞,加入10%二甲基亚砜作为保护剂,液氮中冻存。复苏时将冻存细胞在60℃、2分钟内融化,用台盼蓝染色测定细胞存活率,用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色作细胞鉴定,每日计算细胞数以确定细胞生长曲线。结果显示经冻存复苏后的人视网膜色素上皮细胞的存活率达90%,生长状态与对照组无差异,抗人角蛋白染色阳性,细胞对数生长期在1-4天,群体细胞倍增期约为1.55天。因此人视网膜色素上皮细胞液氮冻存可保持生物活性,复苏后生长良好,保持了细胞特征。这可提供细胞系,方便了体外实验,并可能作为人视网膜色素上皮细胞移植治疗一些眼底病的细胞库。
三、培养和鉴定
有研究进行人视网膜色素上皮细胞的体外培养,为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。
1、方法:用改良的眼杯缝线固定法,将其固定在眼球托上,通过消化获取人人视网膜色素上皮细胞,作细胞形态学、组织化学和电镜鉴定。
2、结果:人视网膜色素上皮细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒,Giemsa染色见染色体,DOPA氧化酶呈阳性反应,透射电镜见细胞微绒毛及紧密连接。、人视网膜色素上皮细胞经体外培养及短期传代后,仍具有与体内细胞相似形态特征。可为人视网膜色素上皮细胞的深入研究提供丰富的实验研究材料。
四、相关研究
有实验研究可见光照对培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞凋亡的影响。以白色荧光灯为光源,用500lx、(2000±500)lx及(3400±200)lx不同光照强度,按不同的光照时间(无光照、6、12、24h)照射培养的人RPE细胞。利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(AnnexinV-FITC/PI)双染色流式细胞测定、相差倒置显微镜等手段观察RPE细胞凋亡(分为光照后6、12、24、36h组)。结果可观察到RPE细胞出现两种死亡形式,凋亡与坏死。
(1)低于一定阈值(500lx)的光照对细胞损伤较轻,细胞凋亡及坏死随光照强度的增加而增加。
(2)在较短的光照时间(6h和12h)内,细胞死亡的增加以凋亡为主;随着光照时间的延长,细胞坏死逐渐明显。
(3)随着光照后培养时间的延长,细胞凋亡明显增加(P0.05)。光照后6、12、24h的损伤改变以凋亡为主,但随时间的延长,凋亡继发性坏死的增加显著。光照后36h,细胞的坏死数显著增高。
此外,有研究探讨天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(caspase)成员caspase-3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡中的变化。方法:原代培养的人RPE细胞经200μg·L-1柔红霉素诱导8,24和36h后,按照caspase-3荧光检测试剂盒说明处理细胞,再通过荧光比色法间接检测细胞碎片中caspase-3的活性。结果正常caspase-3的活性为(0.094±0.005)nmolAFC,8h后增加为(0.446±0.029)nmolAFC,24h后为(0.754±0.056)nmolAFC,36h又下降到(0.486±0.033)nmolAFC,但都高于正常水平。加入特异性四肽抑制物DEVD-CHO1μL后活性为(0.040±0.003)nmolAFC,显著低于正常。因此Caspase-3参与了柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡,柔红霉素可使其活性增加。
另外,有研究探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h。
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