免疫共沉淀Co-IP小能手！1个kit+1个神器帮您轻松搞定！

爱必信

2020/06/11 09:11

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免疫共沉淀Co-IP是研究蛋白间相互作用的经典方法，其以抗体和抗原间的专一性作用为基础，通过偶联beads的Protein A/G与A蛋白及抗体复合物结合，进而将潜在的与A蛋白互作的B蛋白也沉淀下来。一般后续再对拿到的免疫复合物进行WB分析验证。

免疫共沉淀Co-IP示意图

免疫共沉淀Co-IP本身的操作流程并不复杂，麻烦的是相关的操作步骤需要根据实验实际情况进行优化。辛辛苦苦忙活了好一阵子，你拿到的Co-IP结果很可能是这样的。

Co-IP的高背景和抗体污染问题

免疫共沉淀Co-IP的高背景和抗体污染（IgG交叉反应）问题相当令人头疼，以下是小爱整理给到您的优化建议：

1）针对非特异性作用的高背景

细胞裂解物中存在大量蛋白质，可能会在操作过程中发生与目标复合物的非特异性结合。这些非特异性相互作用一般通过彻底清洗beads结合的免疫复合物来清除，但也可以应用其他策略来优化非特异性结合，例如：

▲ 通过将盐浓度从120mM滴定至1000mM来改变缓冲液的离子强度；

▲ 减少一抗的使用量，直到信号干扰比最大化；

▲ 参考我们推荐的操作步骤，进行细胞裂解物预清除。

2）针对抗体污染（IgG交叉反应）

免疫共沉淀Co-IP抗体污染问题是在WB分析中来自IP抗体IgG条带的干扰（IP抗体与WB抗体同源时发生），IgG的轻重链在25kD和50kD左右，并且在SDS-PAGE中可能会有<5kD的偏移。针对这种情况可以采用以下几种方法进行优化：

▲ IP和WB采用不同来源抗体，IP为鼠源则WB可以选用兔抗；

▲ 采用特异性识别IgG轻链或者重链的二抗，如目的蛋白与IgG轻链接近、则可采用重链二抗；

▲ 运用交联剂将IP抗体和Protein A/G -Beads交联，通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体- Protein A/G-beads复合物，最后离心去除复合物，上清中只留下目的蛋白；

▲ WB分析前，可以考虑采用低pH洗脱来代替煮沸，低pH值（2-3）可以降低抗原/抗体相互作用、从而将抗原和抗体分离（如1M甘氨酸缓冲液，pH 2-3），注意电泳前需平衡pH；

▲ 将常用的融合标签（如GFP）掺入用于Co-IP主要靶蛋白中，选用优质特异性的抗融合标签抗体，有需要时还可将该抗体预固定以用于蛋白复合物纯化。

面对Co-IP的高背景和抗体污染，DIY是一种精神，不过我们更推荐1个kit+1个神器助您轻松搞定！

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