细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒

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产品描述：

产品名称：细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒

描述:

该试剂盒可用于细胞浆蛋白与核蛋白的抽提。提取的核蛋白常常用于研究核蛋白间的相互作用，也可用于以纯化的核蛋白为起始材料的研究。该试剂盒，用低渗缓冲液使细胞肿胀。破坏细胞，离心后得到浆蛋白。用高盐缓冲液重悬沉淀，使核蛋白从核中释放。可用于从不同的细胞系及组织中提取有功能的浆蛋白及核蛋白。分离的蛋白适用于western、EMSA、DNA 蛋白相互作用的研究，DNase I印迹分析或相似的技术。

别名: Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit

使用方法: 实验流程： 所有步骤均在2~8°C下进行。所有的试剂及设备均需预冷至2~8°C。确保所有溶液融化并混匀。所有离心均在4°C下进行，并使用预冷的转头。 DTT的终浓度为1mM。蛋白酶抑制剂的终浓度为1%。 一、使用去垢剂从100μL细胞沉淀中分离蛋白 （注：如果细胞沉淀体积不同，可按比例加入相应的各种试剂。） 1、用蒸馏水将1M DTT稀释10倍，终浓度为0.1M。 2、制备1×裂解缓冲液A：用蒸馏水将10×裂解缓冲液A稀释10倍。对于易碎细胞，使用1×裂解缓冲液B（用蒸馏水将5×裂解缓冲液B稀释5倍），代替1×裂解缓冲液A。在500μL 1×裂解缓冲液（A或B）中加入5μL 0.1M DTT，5μL蛋白酶抑制剂。 3、收集细胞 （1）贴壁细胞长至70~90%满 ① 弃培养基；② 用PBS漂洗2次；③ 弃PBS； ④ 加入新鲜PBS后，用细胞刮刀将细胞收集至锥形底的试管中； ⑤ 450g离心5min；⑥ 弃上清。 （2）悬浮细胞 ① 将细胞置于合适的锥形离心管中；② 450g离心5min；③ 弃上清； ④ 用PBS重悬细胞，洗涤2次，450g离心5min；⑤ 弃上清。 4、估算细胞沉淀体积（PCV） 5、在100μL PCV中加入500μL（5倍体积PCV）1×裂解缓冲液A（含DTT和蛋白酶抑制剂）。避免气泡形成。如果体积较小，可将悬浮细胞转移至离心管中。 6、在冰上孵育15min，使细胞肿胀。从裂解液中取5~10μL，在显微镜下观察。如果在显微镜下观察到大量细胞裂解，或观察到凝胶团块，细胞可能易碎。对于易碎细胞，可选用1×裂解缓冲液B裂解细胞，因其为等渗溶液，可不考虑孵育时间。 7、在含有裂解液的肿胀细胞中，加入去垢剂，使其终浓度为6%（在100μL裂解液中加入6μL去垢剂），剧烈涡旋10sec。 8、立即在10000~11000g下离心30sec。 为了评估裂解的程度，离心前，取少量悬浮细胞，在显微镜下观察细胞核。可加入台盼蓝染液（ST050）观察裂解情况。完整细胞拒绝染色，裂解细胞，可染色细胞核。如果在显微镜下观察到核裂解，或观察到凝胶团块，可用较低浓度的去垢剂裂解细胞； 如果不能裂解细胞，可增加去垢剂的终浓度； 对于易碎细胞，应使用较低浓度的去垢剂，避免涡旋细胞，用低速离心。 9、将上清液转移至新的离心管中，为细胞浆蛋白。 10、在98μL提取缓冲液中加入1μL 0.1M DTT，1μL 蛋白酶抑制剂。如果要在低盐浓度下，提取目的蛋白，需用1×稀释及平衡缓冲液稀释提取缓冲液。 注：提取缓冲液的盐浓度是0.42M，适用于通常的抽提。对特定蛋白，为了更好的抽提，可能需要低盐或高盐。如果需要低浓度的盐，应用1×稀释及平衡缓冲液进行稀释；如果需要高浓度的盐，可在提取缓冲液中加入氯化钠，达到需要的浓度。 11、用70μL (2/3倍体积的PCV)含有DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液重悬核沉淀。 12、在室温下放置30min，每2min，以高速度涡旋30sec，尽量避免气泡产生。 13、20000~21000g离心5min。 14、将上清液转移至新的、预冷的离心管中。 15、将上清液置于液氮中快速冷冻，保存于-70°C。 二、不使用去垢剂，从200μL细胞沉淀中提取核蛋白 注：如果不同的体积，需根据情况按比例调整所用试剂。 去垢剂可能干扰提取蛋白的活性。因此，可不用去垢剂进行核蛋白提取。下面流程使用均浆器或注射器制备核提取物。 注：至少需要100μL PCV。对于小规模制备（0.1~1mL），推荐使用注射器(1mL)及针头(27 gauge)。由于针头大小的原因，大于1mL的液体通过注射器可能会比较困难。 1、 用蒸馏水将1M DTT稀释10倍，终浓度为0.1M。 2、 制备1×裂解缓冲液A。对于从易碎细胞中提取蛋白质，制备1×裂解缓冲液B。在1400μL 1×裂解缓冲液（A或B）中加入14μL 0.1M DTT，14μL蛋白酶抑制剂。 3、收集细胞 （1）贴壁细胞 ① 贴壁细胞长至70~90%满；② 弃培养基；③ 用PBS漂洗2次；④ 弃PBS； ⑤ 加入新鲜PBS后，用细胞刮刀将细胞收集至锥形底的试管中； ⑥ 450g离心5min；⑦ 弃上清。 （2）悬浮细胞 ① 将细胞置于合适的锥形离心管中；② 450g离心5min；③ 弃上清； ④ 用PBS重悬细胞，洗涤2次，450g离心5min；⑤ 弃上清。 4、估算细胞沉淀体积（PCV）。 5、在200μL PCV中加入1mL（5倍体积PCV）1×裂解缓冲液（A或B）（含DTT和蛋白酶抑制剂）。轻轻重悬沉淀，避免气泡形成。如果体积较小，可将悬浮细胞转移至离心管中。在冰上孵育15min，使细胞肿胀。 6、将细胞悬液420g离心5min。弃上清，用400μL (2倍体积PCV) 1×裂解缓冲液（A或B）重悬沉淀。 7、细胞破碎 使用玻璃均浆器，将细胞转移至玻璃组织研磨管中。在冰上，使用B型研棒，上下研磨5次，避免气泡产生。或者使用较细的皮下注射针（27 gauge）。在裂解期间，防止空气进入细胞悬液。缓慢的拉注射器，将液体吸入；再缓慢的排除，重复5次。 注：均浆的次数（使用均浆器或注射器）因不同细胞而异。5次均浆后，在显微镜下观察。应裂解80~90%的细胞。如果裂解不充分，可增加均浆次数直至80~90%的细胞裂解。可加入台盼蓝染液（ST050）观察裂解的情况。完整细胞拒绝染色，但可对裂解细胞的细胞核进行染色。如果可见核裂解或核快，或观察到凝胶团块，表明细胞已完全破碎，不能再增加均浆次数。 8、10000~11000g离心20min。 9、将上清液转移至新的试管中，为胞浆蛋白。 10、在147μL提取缓冲液中加入1.5μL 0.1M DTT，1.5μL 蛋白酶抑制剂。如果要在低盐浓度下，提取目的白，需用1×稀释及平衡缓冲液稀释提取缓冲液。 注：提取缓冲液的盐浓度是0.42M，适用于通常的抽提。对特定蛋白，为了更好的抽提，可能需要低盐或高盐。如果需要低浓度的盐，应用1×稀释及平衡缓冲液进行稀释；如果需要高浓度的盐，可在提取缓冲液中加入氯化钠，达到需要的浓度。 11、用140μL (2/3倍体积PCV)含有DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液重悬核沉淀。如果使用的是组织均浆器，推荐在此处再进行10次均浆。 12、轻轻摇晃30min。 13、20000~21000g离心5min。 14、将上清液转移至干净、预冷的试管中。 15、将上清液置于液氮中快速冷冻，保存于-70°C。 三、从100mg组织中提取核蛋白 注：可根据组织的具体重量按比例调整所需试剂的使用量。 1、用蒸馏水将1M DTT稀释10倍，终浓度为0.1M。 2、制备1×裂解缓冲液。 对于组织样本，裂解缓冲液A比裂解缓冲液B更有效。因此，推荐使用1×裂解缓冲液A。如果组织易碎，应使用裂解缓冲液B。 在1000μL 1×裂解缓冲液（A或B）中加入10μL 0.1M DTT，10μL蛋白酶抑制剂。 3、用PBS缓冲液漂洗组织2次，弃PBS。 4、用1000μL (5倍体积PCV) 1×裂解缓冲液（A或B，含DTT及蛋白酶抑制剂）轻轻重悬组织。 5、均浆组织，直至超过90%细胞破碎，可在显微镜下观察细胞核。 6、10,000~11,000g离心20min。 7、将上清液转移至新的试管中，为胞浆蛋白。 8、在147μL 提取缓冲液中加入1.5μL 0.1M DTT，1.5μL蛋白酶抑制剂。 注：如果要在低盐浓度下，提取目的蛋白，需用1×稀释及平衡缓冲液稀释抽提缓冲液。提取缓冲液的盐浓度是0.42M，适用于通常的抽提。对特定蛋白，为了更好的抽提，可能需要低盐或高盐。如果需要低浓度的盐，应用1×稀释及平衡缓冲液进行稀释；如果需要高浓度的盐，可在提取缓冲液中加入氯化钠，达到需要的浓度。 9、用140μL (2/3倍体积PCV)含有DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液重悬核沉淀。短暂的均浆会更利于核蛋白的抽提。 10、轻轻摇晃30min。 11、20000~21000g离心5min。 12、将上清液转移至干净、预冷的试管中。 13、将上清液置于液氮中快速冷冻，保存于-70°C。 四、除盐 根据此实验流程，抽提的核蛋白重悬于提取缓冲液中，该缓冲液为高盐溶液。通常情况，提取的蛋白浓度较高，可用1×稀释及平衡缓冲液进行稀释。在高盐缓冲液中的蛋白足够用于EMSA、footprinting等分析。如果盐干扰下游实验，可使用蛋白沉淀试剂（PR030）去除盐。也可用透析的方法去除盐，透析缓冲液为含有1 mM DTT及1%蛋白酶抑制剂的1×稀释及平衡缓冲液。

储存/保存方法: -20℃保存，有效期12个月

注意事项: 为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等

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