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两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)
Two-Step qRT-PCR Kit
本试剂盒是整合cDNA第一链合成试剂(RT试剂盒)和即用型qPCR试剂而得的qRT-PCR试剂盒。cDNA第一链合成反应和qPCR反应分别在两个离心管中进行。
试剂盒特点:
1.即开即用,足够50次RT反应(10μL体系)和50次qPCR反应(20μL体系)。
2.RT和PCR分开进行,方便优化RT和qPCR条件,也方便一个RT反应用于多个不同引物的qPCR扩增。
3.RT mix中含除酶、模板和引物以外的RT成分,简化了反应设置步骤。
4.qPCR mix是2×预配液,也简化了反应设置步骤。
5.qPCR mix含qPCR染料,无需另外加入相关荧光PCR染料。
6.扩增效率高, 最长可扩增5kbp以上的RNA。
7.提供定量PCR专用模板稀释液,保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。
试剂盒组成:
组分 | 规格 |
2×RT Mix | 40μL(黄盖) |
MMLV逆转录酶(含RI) | 10μL(红盖) |
2×qPCR MagicMix | 1mL(棕色管) |
定量PCR专用模板稀释液 | 1mL(绿盖) |
RNase-free水 | 1mL(蓝盖) |
保存条件:-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂:样品RNA、PCR引物、ROX染料
使用方法:
一、样品RNA的制备(本试剂盒不提供相关试剂)
1.可用自本公司各种RNA 提取方法提取样品的RNA,也可以选用其他供应商的产品,但得到的RNA一定要溶解在 RNase-free的超纯水中。
2.如果需要用RNA制备标准曲线,则需在此步用定量PCR专用模板稀释液将RNA样品稀释不同梯度,并分别作为下步RT反应的模板。
3.由于污染的gDNA会严重影响RNA的定量,因必须彻底去除RNA样品中的gDNA污染。用户可以另购DNase(RNase-free)来消化RNA样品,也可以合成只识别外显子的引物。
二、RT(逆转录)反应合成cDNA
4.按下表配制RT反应体系(10μL体系),在每个管中加入下列成分:
加入物 | 加入量 |
总RNA | 100~500ng |
2×RT mix | 4μL |
MMLV逆转录酶 | 1μL |
RNase-free水 | 补到10μL |
5.42℃保温60分钟。此步为RT反应。
6.85℃保温5秒以终止反应,然后放置在冰上待用。
7.合成的cDNA可以直接作为下步 qPCR模板使用,不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。如果需要用cDNA制备标准曲线,则需在此步用定量PCR专用模板稀释液将cDNA样品稀释不同梯度,并分别作为下步qPCR反应的模板。
三、qPCR(20μL体系)
8.在每个PCR管中加入下列成分:
加入物 | 加入量 |
qPCR MagicMix | 10μL |
cDNA样品(来于上步的RT反应) | 2μL |
PCR正向引物(10pmol/uL) | 1μL |
PCR反向引物(10pmol/uL) | 1μL |
自备ROX染料I或II(见注) | 2μL |
RNase-free水 | 4μL |
注意:如果使用ABI公司的7500,7700和7900三种型号的荧光PCR仪器,则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI7700和7900,ROX的最佳浓度为1×(即在每20μL反应体系中加2μL 10×ROX)。对ABI7500,ROX的最佳浓度为0.05-0.1×(每20μL反应体系加0.1-0.2μL 10×ROX;也可将10×ROX 稀释到1×,然后每个反应体系加入1-2μL 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音,因此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾,然后重新分析数据。
对于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000,RotorGene6000和LightCycler480等型号的荧光PCR仪器,ROX不是必须的,但加入的话也不会影响整个PCR分析。
9.PCR反应参数(需要用户根据模板和引物决定,下面参数的只做参考):
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5min |
PCR反应 (40个循环) | 94℃ | 1min |
55℃ | 1min |
72℃ | 2min |
最后延伸 | 72℃ | 10min |
10.实验结果分析:反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线,制作标准曲线。具体方法随仪器不同而不同,请参考qPCR仪器手册。
浓度3 mM),Mn2+ (50X)
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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