多孔钛合金-含铕壳聚糖水凝胶复合材料的制备及其在促肌腱 -金属假体整合中的初步生物学评价

-- 摘 要 --

前言

人工关节置换是当前骨科常用的修复方式。骨肿瘤、骨感染、人工关节翻修术等患者进行关节置换术时，由于失去肌腱、韧带的天然止点，需要将肌腱、韧带的止点固定在金属关节假体上。在目前临床中，肌腱与金属假体主要依靠机械固定，术后长期可能出现松动甚至失效，影响患者的运动功能。如何促进肌腱-假体界面有效整合，对手术的成败和患者功能的康复有重要意义。

目前人工关节假体常用的钛合金材料具有生物惰性，肌腱无法牢固的附着在金属假体上，且肌腱-假体固定界面由于物理性质的骤然变化出现应力集中，导致了固定容易失效。有研究发现多孔钛合金复合BMP-2，可诱导肌腱-金属固定界面的成骨，在一定程度上增强了肌腱与假体的固定强度。目前对于多孔钛合金材料的结构设计集中于对骨整合的影响，而促进肌腱、韧带等软组织整合的多孔钛合金材料的结构设计尚未见报道。铕元素具有优秀的成骨作用，相对于BMP-2 等细胞因子，具有更好的稳定性，具有作为肌腱-金属界面成骨诱导材料的潜力。

本课题采用3D打印技术，设计、制备多孔钛合金材料，并使用含铕元素的壳聚糖水凝胶对其进行生物活性修饰，制备多孔钛合金-含铕壳聚糖水凝胶复合材料，探索其在肌腱-金属整合中的作用，从而为促进软组织-金属假体整合的应用提供实验依据。

1、3D 打印多孔钛合金材料的制备及其对肌腱长入的影响

1.1 方法

1.1.1 采用隐函数法设计不同孔径的三周期极小曲面多孔材料模型，使用Ti6Al4V合金通过选择性激光熔化制造相应多孔钛合金样品，根据孔隙大小分为Ti300、Ti500、Ti700组。

1.1.2 通过表观体积与实际体积比值计算样品的实际孔隙率、扫描电子显微镜和Micro-CT，观察验证多孔钛合金样品的成型效果。

1.1.3 提取不同孔径钛合金多孔样品的浸提液，使用浸提液在体外培养肌腱来源干细胞，以细胞不同时刻的增殖情况计算细胞的相对增殖率，来评估钛合金多孔样品细胞毒性。

1.1.4 建立兔髌腱-多孔钛合金材料固定模型，根据植入样品孔径分为Solid组、Ti300组、Ti500组、Ti700组。

1.1.5 硬组织切片后苏木素-伊红及天狼星红染色评估肌腱组织在不同组多孔样品的长入情况。

1.1.6 生物力学检测不同组样品肌腱的最大破坏载荷，明确不同孔径的样品对肌腱固定强度的影响。

1.2 结果

1.2.1 扫描电子显微镜观察不同组钛合金样本的表面粗糙，呈现与设计一致的小曲面转角，支柱之间过度平滑。Micro-CT 观察材料内部金属支柱与孔隙排列均匀，孔隙互相连通，计算不同组材料孔隙率Ti300 为78.12%±0.45%，Ti500 为82.76%±0.54%，Ti700 为83.01%±0.58%。

1.2.2 用不同孔径钛合金多孔样品浸提液培养肌腱来源干细胞，相对增殖率与使用普通DMED多糖培养基培养的对照组无显著性差异。

1.2.3 硬组织切片HE染色，术后各时间点Ti500组和Ti700组孔隙内较Ti300组有更多组织充填，第12 周Ti500组孔隙内纤维排列更加有序。天狼星红染色显示第12周Ti500组孔隙内有更多的I型胶原生成。

1.2.4 第12 周Ti300、Ti500、Ti700的最大破坏载荷分别为：44.46±11.26 N，101.62±13.69 N，和54.66±11.17 N；Ti500组显著高于其他两组。

1.3 小结

1.3.1 选择性激光熔化制造多孔Ti6Al4V 合金样品与设计相符，具有规则的孔隙和互相连通的孔道结构，生物相容性好。

1.3.2 500μm孔径的三周期极小曲面多孔钛合金样品能够更好的与肌腱固定，有更好的胶原重塑和更高的力学强度。

2、含铕壳聚糖水凝胶的制备及其对肌腱内骨化的影响

2.1 方法

2.1.1 使用酶消化从大鼠跟腱提取肌腱来源干细胞，并鉴定其干细胞特性和多向分化能力。

2.1.2 使用含不同浓度铕元素的诱导培养基，培养肌腱来源干细胞，实时荧光定量PCR检测不同组细胞成骨分化标志物mRNA的转录水平，免疫印记实验检测第7天的成骨相关蛋白的表达。

2.1.3 配制含1μM，10μM，100μM 铕元素和不含铕元素的壳聚糖水凝胶，使用扫描电子显微镜、光学轮廓仪、X 射线光电子能谱等方式检测其物理、化学性质。

2.1.4 按照上述分组，使用含不同浓度铕元素水凝胶的浸提液与细胞共培养，检测其细胞毒性，使用活死细胞染色检测肌腱来源干细胞在不同组水凝胶上的增殖情况和死亡率。

2.1.5 根据上述实验结果，选用含10μM铕元素的壳聚糖水凝胶作为实验组(Eu10)，不含铕的壳聚糖水凝胶作为对照组(Eu0)。通过大鼠跟腱内注射模型，验证铕元素的体内成骨效应。在注射后的第4周、8周、12周，使用Micro-CT和组织学观察、评估成骨效果。

2.2 结果

2.2.1 从大鼠跟腱获得的细胞P1代呈现克隆集落生长，免疫荧光染色CD31、CD34阴性，CD44、CD90阳性。在相应的诱导培养基培养后，可分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。

2.2.2 成骨诱导培养第7天，10μM铕元素可以显著促进成骨相关标志物ALP，BMP-2和Runx2 mRNA的转录，并增加成骨相关蛋白ALP，BMP-2，Runx2，和OPN的表达量。

2.2.3 壳聚糖水凝胶在电镜下呈片层状-多孔状混合结构。含铕元素的水凝胶在电镜下有更复杂的3D结构，且孔壁表面更加粗糙；在光学轮廓仪上也表现为更高的表面粗糙度。X线能量色散谱和X射线光电子能谱证实铕元素成功掺杂在壳聚糖水凝胶中，且分布均匀。

2.2.4 不含铕元素的水凝胶浸提液表现出轻度毒性，各组含铕元素的水凝胶浸提液都表现为无生物毒性。肌腱来源干细胞在不同组水凝胶培养实验表明，含铕元素的水凝胶和不含铕元素的水凝胶对比，在第5 天有更多的细胞数量。

2.2.5 在大鼠跟腱内注射后第8 周、12 周，Eu10 组跟腱内矿化的体积分别为1.462±0.283 mm³和2.978±0.769 mm³，显著高于同时间点Eu0 组跟腱内矿化体积。免疫组化染色结果显示在注射后第8 周、12 周，Eu10 组水凝胶周围组织的成骨相关标志物ALP、BMP-2，成软骨相关标志物Aggrecan 以及软骨内骨化标志物Col X 的阳性率均显著高于Eu0 组。Eu10 组第12周番红O-固绿染色可见红染的类软骨样区域。

2.3 小结

2.3.1 成功提取大鼠肌腱来源干细胞。

2.3.2 明确了铕元素在体外诱导成骨的适宜浓度为10μM。

2.3.3 成功制备掺杂铕元素的壳聚糖水凝胶。

2.3.4 使用大鼠跟腱内水凝胶注射模型，验证了10μM 铕元素的壳聚糖水凝胶相对于不含铕元素的水凝胶可以显著促进大鼠跟腱内成骨。

3、多孔钛合金-含铕壳聚糖水凝胶复合材料对肌腱内成骨和肌腱-金属假体整合的影响

3.1 方法

3.1.1 使用冻干法制备多孔钛合金-水凝胶复合材料，复合了不含铕的水凝胶和含铕水凝胶的复合材料分别定义为Ti-G组和Ti-E组。扫描电子显微镜观察复合材料结构。

3.1.2 检测材料的细胞播种效率和播种于材料上的细胞增殖情况，以明确其细胞相容性。

3.1.3 建立兔髌腱-复合材料固定模型。

3.1.4 兔模型建立后的第4周、8周、12周，使用Micro-CT和硬组织切片后亚甲基蓝-酸性品红染色，检测组织内成骨效果。

3.1.5 兔模型建立后第12周，生物力学检测不同组样品最大破坏载荷，明确多孔钛合金-含铕水凝胶复合材料样品对肌腱固定强度的影响。

3.2 结果

3.2.1 扫描电子显微镜观察到水凝胶完全填充在金属支柱的原始孔隙中，呈现片层状疏松、多孔结构，Ti-E组水凝胶孔隙更加精细、均匀；X线能量色散谱证实Ti-E组铕原子量与氧原子的比例约为0.33%，符合设计铕元素浓度。

3.2.2 Ti-G组和Ti-E组的细胞播种效率分别为73.36%±5.48%和76.26%±3.53%，高于单纯金属材料的细胞播种效率。细胞播种后均能在材料表面良好增殖。

3.2.3 术后第4周硬组织切片染色即可识别Ti-E组复合材料表面的矿化区域，术后第8周、第12周硬组织切片和Micro-CT均可识别Ti-E组复合材料表面的矿化区域，成骨体积分别为1.293±0.332 mm³和1.316±0.702 mm³。Ti-G组未见矿化。

3.2.4 术后第12周，Ti-G和Ti-E的最大破坏载荷分别为88.15±12.37 N 和151.91±10.94 N，两者有显著性差异。与单纯金属材料对比，Ti-G组最大破坏载荷小于相应孔径的Ti500组，Ti-E组最大破坏载荷大于Ti500组。

3.3 小结

3.3.1 成功制备金属-水凝胶复合材料，Ti-G组与Ti-E组材料均具有良好的生物相容性。

3.3.2 金属-含铕壳聚糖水凝胶复合材料在兔髌腱内显示良好的成骨效应。

3.3.3 金属-含铕壳聚糖水凝胶复合材料增强了肌腱在材料表面的固定强度。

全文总结

本研究优化了多孔钛合金肌腱固定点的多孔结构设计，确定了用于诱导肌腱成骨的壳聚糖水凝胶中铕元素的适宜浓度，制备了多孔钛合金-含铕壳聚糖水凝胶复合材料，并验证其可以在体内诱导肌腱在钛合金表面成骨并加强肌腱在金属材料上的固定。

关键词：关节假体，选择性激光熔化，多孔钛合金，肌腱固定，骨化。

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