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荧光PCR检测进入“分钟”级时代:百泰克23分钟RNA检测技术

百泰克生物

2022/07/06 09:45

阅读:150

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新冠疫情的爆发,使得全球卷入了这场没有硝烟的战斗中,相较2021年,疫情虽正在往好的方向发展,但全球确诊人数依然超过5.4亿1,2



等温扩增


核酸检测是确诊 SARS-CoV-2 感染的最主要依据。目前可用于 RNA 病毒的核酸检测技术主要有基因测序、聚合酶链式反应(PCR)、等温核酸扩增等。其中荧光定量PCR检测方法是首选方案3


然而反转录实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)的检测方法需要依赖温控精度良好的热循环仪,并且PCR反应中必须的变性、退火和延伸步骤,使整个扩增检测时间较长,难以实现对SARS-CoV-2的现场快速检测4


核酸等温扩增技术无需热循环仪,扩增反应效率高、速度快,非常适合于病原体核酸的现场快速检测。因此不少相关从业人员,都曾把核酸快速检测的希望,寄托于等温扩增技术上面。



不同等温扩增技术优劣


不少核酸等温扩增方法已相继被用于SARS-CoV-2的检测。包括依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、交叉引发扩增技术(CPA)、切刻内切酶核酸扩增反应(NEAR)等。


这些技术原理各异,产物检测方法各不相同,造成它们在检测SARS-CoV-2时的灵敏度、特异性、靶标基因、所需仪器、检测时间等方面存在差异。




市面上这几种等温扩增的方法各有优缺点,以下来分析



SAT是在 NASBA 技术的基础上,进一步提高了检测的灵敏度和特异性,但是并未能从根本上克服NASBA 技术反应时间长的问题。 


荧光RT-RAA法荧光RAA方法灵敏度较高。但是对样品核酸品质要求较高,需要搭配传统的提取方法。并且样品同一时间只能检测单一靶标基因。 


CPA实时荧光法:CPA扩增产物采用分子信标进行检测,然而这个方法的通量太小。此外交叉引物的设计要求较高,在研发过程中,引物的筛选和测试,十分繁琐。这可能会造成基于该技术的检测试剂平台开发周期较长4 。


LAMP芯片法:可利用肉眼观察颜色变化,或灰度检测来判读检测结果,虽然降低了对仪器设备的要求,适合在资源有限和经济不发达地区开展核酸检测,然而主观判断颜色变化存在较大个体差异5,有可能影响结果判读。


此外国外,曾经有相关研究人员就新冠病毒检测,针对LAMP 实验方法,以及商品化新冠检测试剂盒的作一个对比,对不同浓度的阳性样品进行检测对比,结果如下表所示6:



结果显示在中低浓度的阳性样品中,LAMP法与荧光定量PCR对比,阳性检出率较低,而且检测下限也较差。




除了上述提到的情况外,等温扩增还有以下一些问题





1、样品前处理(核酸提取)是等温扩增一个主要制约因素。


2、如何实现单管闭管条件下的多重或多靶标等温扩增检测,并同时具有高灵敏度和特异性,也是亟待解决的技术难题。


3、在理论上等温扩增技术不能够通过反应时间来指示核酸扩增量,这难以实现精准的定量检测,更加适合于半定量或定性检测。


4、某些等温扩增方法,如 LAMP 等温扩增涉及多个引物,往往需要通过优化引物设计来确保核酸检测的特异性与灵敏度,这提高了其技术实现难度8




现阶段而言,某些等温扩增技术具有一定现场应用的前景,然而目前的产品通量偏低,时间偏长和灵敏度偏低,还是限制了这项技术的应用场景7。这些缺点限制了等温扩增的发展,也造成了等温扩增技术空有好的设想却迟迟无法落地的困境。


那有没有既兼具了等温扩增快速、仪器简单的特点,而又有传统荧光定量PCR特异性好、准确度高的检测方法?答案是有的。快速荧光定量PCR就是这个问题的终极解决方法。它既有传统荧光定量PCR准确度高,灵敏度好的特点,而又通过技术革新,具备比等温扩增更快速完成实验的能力。




革新



传统的荧光定量PCR实验时间长,是由于受到仪器升降温速度,以及传热的效率所限,整个实验时间时长一般为70-120分钟。


一般来说,荧光定量PCR反应的温度条件是较为固定的,既然无法改变温度条件,若想提高整个实验的速度,那么只能从两方面着手进行优化:一是提升温控性能,二是提高热传递效率。



百泰克公司历时三年研发的PCR仪,就是从这两方面入手,打破传统荧光PCR反应时间的枷锁,为整个荧光定量PCR技术带来革新。





百泰克快速荧光定量PCR仪BTK-8,采用先进的升降温模块,升降温可达12℃/s,平均升降温速度为10℃/s,为传统荧光PCR仪的3-5倍。由于变温PCR反应时,温度需要从58℃提升至95℃,再降至58℃,如此循环40~45次,因此升降温速率的提升可将原本70-120min的检测提速至20~30min完成。



耗材方面,BTK-8摒弃了传统的0.1ml、0.2ml PCR反应管,采用新型的注塑工艺与柔性膜结合技术,研发芯片式反应耗材,适合大规模机械化生产,成本进一步降低。


单个芯片包含有10个独立的样品孔,芯片加样孔较小,不容易与空气进行交换,从而大大降低了孔洞间的气溶胶交叉污染的可能性,检测体系具有超高的检测准确性,可达到ABI Q6同等灵敏度,且芯片加样无需离心去掉气泡,操作起来更加便捷。


 

从下表可以看出,现在BTK-8这款快速定量PCR仪,已经能把实验时间压缩至30分钟以下,而且检测下限能够达到200 copies/ml,能满足现在的检测需求。相比于等温扩增技术,快速荧光PCR的时间更短、准确性更高。






结语



在过去的时间内,等温扩增技术凭借其简单快速、便于在基层单位推广的特点,在部分人畜共患病、妇科恶性肿瘤、以及多种呼吸道疾病的检测中发挥着一定的作用。然而伴随着BTK-8快速荧光PCR仪的横空出世,使得相关的检测有了一个更好的选择。能提供更快捷、准确实验结果的快速荧光定量PCR仪,将会完美替代等温扩增的检测手段,在多个领域中发挥巨大作用。


特别是在新型冠状病毒疫情仍然全球流行的时期,由于各国防控情况不平衡,新型冠状病毒或将在相当长的一段时间内与人类共存,甚至有可能会成为一种长期存在的一种呼吸道传播病原体。而在口岸快速排查,基层发热门诊快速分流的实际需求,均要求能够提供快速、准确、有效的实验检测结果。相比于等温扩增技术、BTK-8快速荧光PCR仪则更能满足这些场景的需求。



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