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流式配色告别烦恼，四步策略轻松上手
流式实验中让许多人望而却步的莫过于多色配色，多色方案搭配没做好，就相当于房屋搭建地基没打牢。伴随着研究的深入，方案颜色越多，需要考虑到的细节更是千丝万缕，所以找准方向、理顺思路，才能起到事半功倍的效果。工欲善其事，必先利其器。全光谱流式细胞仪Cytek®Aurora的问世，让一管实现40+色的梦想照进现实，也让多色实验最让人头疼的配色门槛大大降低。这场来自Cytek®资深应用专家Laura Johnton的精彩讲座，用清晰的四步走策略带领我们从入门到精通，轻松打通多色流式实验关卡。
贯穿讲座的整体思路，从梳理标志物—筛选荧光素—设计方案—优化方案，流式多色方案搭配遵循四步走策略。
第一步 梳理标志物
明确研究课题涉及到的目的细胞上的生物学标志物表达，包括骨架系别标记、细胞亚群或功能性标记、排除标记等，通过细化分群，精准定位到感兴趣的靶标细胞。其中抗原标志物的共表达情况，可以通过逻辑树或流式门控策略进行梳理。
选择市面可用的试剂，信息获取渠道如试剂厂家官网说明书，相关研究领域发表的文献，Cytometry Part A杂志旗下专栏Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels（OMIP）系列，Frontiers in immunology杂志发表的CD Maps一文，了解可用的试剂选择、推荐的抗体克隆号和样本制备的条件等。确定好目的细胞特异性抗原后，按照表达丰度将其归类到一类、二类和三类抗原，遵循强弱搭配原则匹配对应亮度适宜的荧光素。
第二步 筛选荧光素
流式细胞仪的配置支持哪些荧光试剂呢？对于传统流式需要考虑激光器和滤光片可检测范围，而全光谱流式则只需要考虑激光器即可。以5激光的Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪为例，其能够广泛兼容市面上传统和新型的荧光染料。全光谱流式搭载专利的Full spectrum profilingTM（FSPTM）技术，扫描荧光素发射光谱的完整指纹信息，也为仪器的光学灵敏度带来质的飞跃。
荧光素的筛选遵循3项标准：独特性、亮度、溢漏扩散
筛选标准1：荧光光谱的独特性。荧光发射光谱形状差异越大，就更容易被区分开，Cytek®相似指数（SimilarityTM Index）让这一判断变得有据可依。通过定量的数值0~1，代表着一对荧光组合光谱相似度从低到高，当相似指数>0.98，不建议荧光组合在一个方案中同时使用。
基于Cytek®复杂指数（ComplexityTM Index），能够全局性地预估所有荧光素组合在同一个方案中的适配性。以3激光Cytek®全光谱流式细胞仪运行14色cFluor® kit为例，复杂指数在7.89，这一数值就可以作为14色左右的方案优化的参考标准，数值越低说明方案搭配更好。
筛选标准2：荧光素的亮度。衡量荧光素亮度的参数之一是染色指数，Cytek®测试了上百种荧光素在5激光Aurora全光谱流式细胞仪上的染色指数，从低到高进行了排序并录入到Cytek®荧光指南中，可以作为荧光素去匹配不同表达强度抗原时的参考标准。
筛选标准3：荧光溢漏扩散。问题的“罪魁祸首”来自于荧光发射光谱的重叠，全光谱流式光谱拟合能够直观地追溯到问题的来源。溢漏扩散随着光谱重合度、荧光亮度、抗原表达丰度发生变化。为了简化这一概念的理解，SIR矩阵通过色块深浅可视化展示溢漏扩散的程度高低，矩阵行中的荧光素对列的溢漏扩散越大，则颜色越红。
第三步 设计方案
方案搭配千头万绪，不知从何开始？Cytek® Cloud云端平台将上述提及的所有知识点精华都荟萃在Panel Builder小工具中，引导式的界面让新手也能快速掌握流式配色的秘诀。Cytek® Cloud平台集成了三个在线工具，Full Spectrum Viewer、Panel Builder和Experiment Builder，内置了目前已发表的所有OMIP方案库和Cytek® cFluor® kit方案。平台从多色配色到一键导出实验模板，实现方案设计到数据采集的无缝衔接。
目前Cytek® Cloud平台已面向所有Cytek®全光谱流式用户开放，欢迎访问：http://cloud.cytekbio.com，免费注册您的专属账户（仅支持企业或教育邮箱）。
第四步 优化方案
好方案追求的是所有感兴趣的细胞亚群都能够被清晰地分辨。优化方案前提需要保证完成抗体滴定、高质量单标制备和解析准确等步骤，通过细胞单标与多标管的分辨率平行对比，能够作为是否需要进行方案优化的直观判断依据。当问题锁定到荧光溢漏扩散时，借助SIR矩阵可以揪出带来spread的荧光素“元凶”，如果该荧光指标与受影响的指标属于非共表达，并不会影响目的细胞亚群的分辨率，就无需调整方案。
在聆听这场讲座之前，也欢迎大家阅读：Cytek® 推出全新SpectroLearn™系列，助您轻松玩转多色方案设计（内附视频）一文，提前解锁全光谱流式方案设计小技能。
关于Cytek
About Cytek /
Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术领先的生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 ——Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。
更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。
注：Cytek®, Tonbo Biosciences, cFluor®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。
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