AML MRD方案评估：1管19色全光谱流式方案与5管8色传统流式方案的对比

多参数流式细胞术（Multiparameter flow cytometry, MFC） 是检测急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML）微小残留病 （Minimal residual disease, MRD） 的标准方法之一。由于传统流式细胞仪的可用通道数量有限，限制了单个试管内抗体组合的数量，所以针对AML-MRD的多参数检测，往往需要将待测样本分成多个试管，对检测用细胞数量，以及复杂免疫表型的分析都带来了许多挑战。

全光谱流式细胞术相较于传统流式的优势之一就是能够区分数量大大增加的荧光染料，3激光仪器可同时使用超过24种荧光染料（图1），5激光仪器可超过 40 种荧光染料，从而克服了上述检测限制。

图1- Cytek^® NL-CLC系统可在一管样本中
同时检测超过24种荧光染料

来自德国汉诺威医学院的研究团队，基于全光谱流式开发了一个符合GLP（ Good laboratory practice）的单管 19 色 MRD 检测方案，该检测方案同时符合欧洲LeukemiaNet Flow-MRD工作组的建议。为了验证该19色方案的检测性能，研究团队在IVD认证的全谱流式细胞仪（Cytek^® NL-CLC系统）上对方案进行了全面评估。

5 管8色传统流式方案与1管19色全光谱流式方案的检测标记和荧光染料如下图2所示（图2）。检测样本包括20例健康供者，和37例AML患者不同疾病时间点的骨髓样本。选择AML细胞系SEM和ME-1来建立相关荧光素特征光谱的参考对照。

图2- 5 管8色传统流式方案与1管19色全光谱流式方案

处理好的样本区别在BD FACS Canto II和Cytek^® Northern Lights^™- CLC（NL-CLC）流式细胞仪器上进行了数据获取（图3A）。使用 Infinicyt™ 软件（Cytognos, S.L., Salamanca, Spain）和GemStone™软件（Verity Software House in Topsham, Maine, USA）对数据进行分析，两个仪器平台获取的数据均采用了相同的门控策略，该分析方法除检测MRD外，还可以评估粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、原始细胞、B细胞和CD4+ T细胞等的相对比例。接下来， 研究者进一步对这些分析结果进行了比较。

1. 主要白细胞亚群比例的鉴定：19色全光谱方案与5管传统方案结果相似

研究者比较了两个方案所鉴定出的代表性细胞亚群比例。通过线性回归模型计算各细胞群r²，发现两个方案之间存在很强的相关性 （n = 37）：粒细胞为0.96，淋巴细胞为0.95，单核细胞为0.98，原始细胞为0.98，B淋巴细胞为0.95，CD4+T细胞为0.98（图3B-G）。提示利用这两个方案鉴定出的人骨髓主要白细胞亚群比例具有非常高的一致性，这表明 1 管19色方案可以取得与 5 管方案相当的结果，也证明了该方案后续对稀有细胞群检测的验证是合理的。

图3- 5 管传统方案和 1 管全谱流式方案的比较

2. 单管19色方案符合临床应用质量要求

为了将该单管19色方案检测进行临床转化，研究者在IVD认证的全光谱流式仪器（Cytek^®NL-CLC）仪上，对方案的特异性、灵敏度和重现性等进行了验证。主要通过空白限（Limit of Blank, LoB）、检测限（Limit of Ddetection, LoD）、定量限（Limit of Quantification, LoQ）、检测内和检测间变异性（intra- and inter-assay variability）和线性（linearity）等参数进行评估。其中，对四种常见的AML-LAIPs检测的LoQ 均低于0.01%（图4A），低于ELN指南推荐的临床cut-off值0.1%。检测内平均变异系数（CV）均低于20%，大多数情况平均%CV小于10%（图4B）。而检测间的平均%CV均低于10%的预期阈值（图4C）。将KG-1细胞的测量浓度和预期浓度进行比较，并对该数据进行线性回归，每个测得的LAIP的 r²值均大于0.99（图4D-G）。将患者样本的CD34+CD13+CD56+ 细胞按比例加入正常 骨髓并进行检测，测量浓度与预期浓度的线性回归显示r²值>0.98（图4F）。综上，研究者验证了该1管19色AML-MRD方案符合临床应用的规范要求。

图4- 通过确定 LoB、LoQ、LoD、检测内

和检测间的变异性和线性来验证 1 管19色方案

3.  单管19色方案对常见LAIP 的检测具有特异性

研究者进一步验证了单管19色方案的检测特异性，即对背景信号的区分。通过对20 个健康骨髓样本的测试显示，单管19色方案检测到的23个LAIPs的细胞平均百分比及95% 置信区间均低于 0.1%，证明单管方案具有很好的特异性。

4. MRD检测：19色全光谱方案与5管传统方案结果高度一致

对37例AML样本的检测结果显示，单管19色方案与传统方案在AML-MRD 的检测上，结果完全匹配，均能区分MRD-（n=30）和MRD+（n=7）的AML样本。因此，研究者认为，两个方案在AML-MRD的检测应用中具有高度一致性。（图5）

图5- 全光谱和传统流式方案的 MRD 检测比较

5.与传统方案相比，单管19色方案的分辨率更高

传统方案由于在各管使用的抗体数量有限，限制了可评估的免疫表型组合数量。单管方案克服了这一限制，可以检测更多的LAIPs。图6显示了一个经传统方案检测认定为MRD-的样本，但利用19色方案，却发现了一个未分类的细胞群，进一步分析发现该细胞群具有CD34_dimCD117−CD13−CD33++HLA-DR_posCD22+ 表型，其中 CD33++ 和 CD22+ 是定义该LAIP的主要标记。值得注意的是，由于CD33和CD22分别包含在5管方案的不同管中，因此传统方案通常会遗漏该LAIP。这突显了单管19色方案在提升MRD检测灵敏度方面的价值，也提示使用高维数据进行LAIP评估和指导临床决策具有一定的优势。

图6- 以一个代表性示例来展示分析工作流程

研究团队指出，传统流式检测AML-MRD可能存在一些局限，比如，可重复性有限，处理细胞含量少的样本时存在困难，数据解释存在差异等。而他们设计的全光谱流式工作流程很好的克服这些问题，不仅能够获得跟传统方案高度一致的检测结果，还具有更高灵敏度，帮助发现传统检测中可能遗漏的LAIPs。

总体而言，研究者通过系列验证，证明了基于全光谱流式细胞术的多色panel在AML-MRD应用中的优势。全光谱流式细胞术的兴起，推动了血液病检测的发展，最近有研究显示在3激光配置的全光谱流式仪器上，可实现多达31个标记物的检测方案，这表明该19色方案仍有可拓展的空间，另外，荧光染料的不断丰富也将进一步简化更全面的临床panel的构建。