Cytek®Amnis®量化成像流式技术应用——细胞互作篇

细胞-细胞相互作用（细胞互作）是指细胞表面之间的直接相互作用，其在多细胞生物的发育和功能中起着至关重要的作用。这些相互作用使细胞能够相互沟通，以应对微环境的变化。细胞粘附、组织发育、细胞通讯、炎症、肿瘤转移和微生物感染等许多过程都需要细胞互作。

有的细胞互作是稳定的，比如特定组织内细胞连接的形成，它们参与了细胞间的通讯和组织。有的细胞互作是短暂的或暂时的，如免疫系统细胞之间的反应，白细胞与恶性细胞或组织炎症部位的相互作用。

图1 – T细胞和APCs细胞互作示意图

免疫细胞突触就是细胞互作的一种形式。以T细胞和APC为例，抗原特异性T细胞对抗原呈递细胞（APCs）的持续粘附和免疫突触的形成是T细胞受体（TCR）刺激和抗原特异性免疫反应所必需的。两者之间的相互作用涉及细胞骨架重组、黏附分子和信号分子在细胞间接触部位的募集（图1）。为了形成免疫突触，粘附分子之间必须发生结合，比如T细胞上的白细胞功能抗原-1（LFA-1）和APC上的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的结合，这些低亲和力的短暂相互作用有助于使对应的T细胞受体（TCR）和MHC足够接近并产生相互作用。有效免疫突触形成的一个重要方面是细胞膜丝状肌动蛋白（f-actin）重排成聚合物。这可以通过使用phalloidin试剂进行细胞内染色来测量（图2）。

图2-免疫突触的结构

长期以来，由于可用的技术有限，及缺乏用于原位功能检测的试剂，评估免疫突触的形成一直是免疫学界的一个挑战。传统的方法主要通过显微镜（包括荧光，共聚焦和扫描电子）直接可视化免疫突触，但存在许多局限性，比如只能观测到某些特定情况下形成的免疫突触，不能对较大量的相互作用细胞对进行量化，也不允许在不同测试条件之间进行可靠的统计学比较。

多参数成像流式细胞术（MIFC）通过将高速自动图像采集与定量图像分析相结合，以标准化和统计的方式，提供基于荧光强度和外观对细胞进行识别所需要的所有参数，可以对活的、离体的免疫细胞之间的相互作用进行定量、高通量分析。利用成像流式细胞术测量免疫突触，可以客观的测量大量的相互作用细胞对，并允许在同一细胞上并行的、实时的评估免疫突触的多个标记物。是一种评估免疫突触的精确而有统计意义的方法。（图3）

图3-Cytek^®Amnis^®ImageStream^®X Mk II

成像流式细胞仪

利用Cytek^®Amnis^®ImageStream^®X Mk II成像流式细胞仪，在低速设置下以60倍放大倍率采集10,000个细胞事件，T-DC细胞偶联的阴性对照和阳性对照分别如图4A-B所示（图4）。

图4- T-DC细胞偶联的阴性对照和阳性对照

用于分析的设门策略如图5所示，首先根据“gradient RMS”特征选择聚焦的细胞，然后选择可能与doublets一致的宽高比。为了进一步完善，我们对CFSE和CD11c双阳性细胞进行了设门。使用这种策略，T-DC细胞偶联体被成功地识别（图5A）。选择高质量、聚焦在观察窗口内的T-DC偶联体进行最终设门，得到的全染色Pannel的阳性和阴性对照（图5B）。

采用Ideas软件6.1离线分析，为了测量免疫突触，研究了几种Mask策略，结果显示对该人群最有效的是Interface Mask工具（图5C）示。使用Interface Mask时，首先根据T细胞和DC的荧光使用单个object Mask进行鉴定（T细胞使用CFSE标记，DC使用CD11c APC-Cy7进行分选，因此成像流式细胞术分析时仍带有该抗体）。可以根据用户定义的细胞表面周围的像素数选择扩展或侵蚀Mask，在这个研究示例中，T细胞和DC识别Mask都使用了“Tight”Mask（图5C)。然后使用Interface Mask来识别相互接触的T细胞“Object”和DC “Object”中的像素，使用8个像素的扩展来捕获Interface Mask。所得到的Mask示例如图5D所示，用于阳性和阴性对照的双阳群体。

图5- 识别T-DC细胞偶联体的设门策略

该技术可对相互作用的T细胞和DC进行量化，并测量T和DC作用界面上的表面LFA-1和/或细胞内因子（phalloidin）的强度。在这项研究中，研究者最感兴趣的是DC对T细胞的作用，因此采用了单边Mask技术，及通过在定义Mask时将T细胞定义为感兴趣的对象来实现的。免疫突触标记物的荧光强度可通过T细胞与DC交界面处phalloidin荧光强度的“特征值”来评估。要创建此特征，选择“Intensity”作为感兴趣的参数，并将如上所述的Interface Mask应用于感兴趣的图像/通道(在本例中为phalloidin/Ch11)。通过导出特征值（即T细胞与DC交界面的phalloidin强度值）绘制得到的强度数据如图5E所示。LFA-1的分析遵循了以往研究（Markey et al, Journal of Immunology, 2014）相同的过程。

综上可见，成像流式细胞术不仅可精确识别两个不同细胞结合的偶联体，同时可以自定义两个细胞间的Interface Mask，通过统计Interface Mask下的信号强度精准判定细胞间突触与非突触作用，从而客观的统计突触群体比例。这些特征体现了成像流式的独特之处，也是常规显微成像和传统流式所无法媲美的。