高效液相色谱（HPLC）分离效果好，速度快，样品容量大，回收率高，已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：HPLC能够分离具有几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。仅相差一个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC分离。胰岛素变异物的分子量都在5300左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变异物都可以用RP-HPLC分离。特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！其次，高效液相色谱在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成对多肽的分离目的，更重要的是该法能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。