浅谈反相柱走高水相2

         从实验结果可以看出，对于5μm，10nm孔径的C18反相柱来说，温度越高，泵停止后再次进样保留时间的损失越大。而在30摄氏度和40摄氏度时即使在泵未停的情况下，保留时间都已经开始降低。解释这个现象恐怕要由十八烷的熔点说起，十八烷的熔点在29–30 °C，但是在二氧化硅微球表面键合的C18并不是和十八烷具有相同的相转变行为，因为C18链的一端是嫁接在硅胶表面的。Doyle 和他的合作伙伴用拉曼光谱研究了键合后的C18链在2–45 °C之间的光谱变化特征，随着温度得变化，C18链的光谱更加类似于液体十八烷的光谱特性，但是变化是逐渐而且连续的。这和图三得到的实验现象完全一致，保留行为的变化是渐进连续的，没有任何突变的迹象。同时这个结论也提示我们，如果需要在高水相条件下使用反相柱，为了提高实验的重复性，尽可能地选择在较低温度下运行。

         在此处，小编引用一篇已经发表的数据。通过评估氢键结合能力，测量了键合相上残留的硅羟基基团的数量。氢键结合力越高，残留的硅羟基的数量越多。如表二所示，更广泛的封端减少了残留的硅羟基基团的数量，从而导致保留时间的重现性差。残留的硅羟基基团在固定相上作为极性基团起作用。具有高残留硅羟基含量的固定相的极性很高，因此，这些相与保留的极性相（如烷基酰胺和烷基氨基甲酸酯相）一样，具有很高的保留重现性。虽然没有封尾的反相柱具有很高的保留重现性，但是在中性pH和高水相条件下不稳定，因此这种类型的C18柱不能够在实际的分离案例中应用。

         图四说明了盐和离子对试剂的作用。如这些图所示，相对保留率很大程度上受盐和离子对试剂浓度的影响。仅5 mM的离子对试剂显示出非常高的保留重现性。我们认为，盐和离子对试剂降低了流动相的表面张力，同时使固定相更具亲水性。由于表面张力低，亲水性高的固定相很容易将流动相保留在孔中。从填料的孔中排出水性流动相后，我们用浓度大于50％的有机溶剂洗脱了流动相，使流动相返回到孔中。在每次评估结束时，我们用70:30（v / v）乙腈-水冲洗色谱柱，并且色谱柱始终返回其初始状态。我们使用同一根色谱柱重复了几次实验，每次都获得相同的结果。

         如图五所示，由于填料出口附近的压力非常低，因此从填料的孔隙中将其排出。如果在柱后和检测器之间接一根内径0.1 毫米，50厘米 长的管子，由于管径变细而阻力加大，在柱后会产生一定的压力。如果图五当背压为1.7 MPa，导致2-丙醇的保留时间从6.5分钟增加到7.2分钟。该背压也被认为是降低保留的再现性的因素。因此，柱后的背压使得保留的重现性高。在实际操作中，分析人员如果需要走高水相条件时，为了提高实验的高重复性，可以采用这个方法。

反相HPLC色谱柱在100％水性条件下显示保留率降低，因为在这些条件下，流动相从填料的孔中排出，这导致固定相和流动相之间的接触减少。一些关键参数（温度，压力，封端以及盐和离子对试剂的浓度）会影响保留率的降低。并且操作温度低于10°C或向流动相中添加5 mM离子对试剂时，即使是普通的C18 HPLC色谱柱也能在100％的水相条件下显示出较高的保留重现性。