浅谈反相柱走高水相

酝博

2020/07/21 16:49

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目前，反相C18色谱柱由于其广泛的适用性和卓越的耐久性依然是最常用的色谱柱。当需要分析一些极性亲水性化合物时，我们需要尽可能少的有机相作为流动相，来达到分离效果。本质上说，普通C18固定相不适于用单纯全水相，或者含有盐的酸碱缓冲液的全水或高水相，原因是样品的保留时间很难重现，色谱柱使用周期相对较短。这种现象通常都归咎于C18链的脱落和固定相的塌陷。

为了解决这个问题，各个厂家开发出不同技术适用于全水相的C18色谱柱，如在C18的底端加入极性基团或采用极性基团封尾。由于这些固定相引入了极性基团，可以改善分离效果，但是缩短了基质的保留时间而大大降低了分离选择性。所以依然有众多用户使用普通C18柱。

今天我们来做个小小的实验，来看看在高水相条件下，为什么普通C18的保留性能会有这么大的变化，到底是不是C18链的脱落和色谱柱的塌陷而引起的？还是有其它的原因？问题到底出在哪儿？

这儿我们用亚硝酸盐和2-丙醇作为2个亲水极性化合物为代表。

图一：C18色谱柱在100％的全水流动相条件下的保留行为。

（A）首次进样结果（B）在停止泵1小时然，启动后的结果。

色谱柱：150 mm x 4.6 mm，5μm，C18，孔径10 nm; 流动相，100%水；流速1.0 mL / min; 柱40°C；柱后出口的施加压力1.7 MPa。峰1 ＝亚硝酸钠（t 0），峰2 ＝ 2-丙醇（t1）。

在这个实验中，我们测量了色谱柱重量。初始条件下当色谱柱压降为0MPa后，立即取下，同时封上两端，称重作为起始重量。然后，我们将色谱柱装回，在停泵1个小时后，再取下色谱柱封上两端称量作为1小时后的重量。从下表中我们可以看出色谱柱的重量减少了0.6克。为了进一步查明水的流失时间和去向，我们在柱压降到0 MPa时，取下色谱柱出口端，我们观察到在没有流动相流入的情况下，有0.3毫升水在一分钟内流出，剩下的0.3毫升在10分钟内留出。为了让色谱柱恢复初始状态，再次使用足量的乙腈/水70:30（v / v）为流动相冲洗色谱柱。

表1：在100％水性流动相条件下C18色谱柱的保留时间和重量

实验结果表明，水从色谱柱流出。那么流出的水是来自于填料微球之间的水还是微球孔内的水呢？而微球孔内外的水对于分离效果又有什么样的影响呢？

对于C18填料来说，色谱柱的孔内布满了完全亲油性的C18链。而对于高含水量的流动相来说，“呆在孔里”是一个非常不舒服的状态。影响高水相流动相在色谱柱内分布的因素有很多，比如孔径大小，表面键合密度，键合相长短，表面硅羟基残留，色谱柱长短，色谱柱压力，运行温度等，这些具体的影响因素研究小编后期会逐一进行阐述。希望您持续地关注和支持我们。

下图中的相对保留时间比值是指停泵一小时后的保留时间与起始保留时间的比值。我们可以看到4号和5号实验，色谱柱填料孔内充满流动相时，相对保留时间比值接近1，说明若高水流动相进入到填料孔隙中，那么出峰时间就会相对稳定。相对保留时间比值和填料孔内的高水相量呈正比关系