索氏提取脂肪测定仪之重量分析法

1概述
食品中的脂类主要包括脂肪（甘油三酸脂）和一些类脂质，如脂肪酸、磷脂、糖脂、甾醇、固醇等，大多数动物性食品及某些植物性食品（如种子、果实、果仁）都含有天然脂肪或类脂化合物。
各种食品含脂量各不相同，其中植物性或动物性油脂中脂肪含量Z高，而水果蔬菜中脂肪含量很低。
（1）脂肪在食品与食品加工中的作用
脂肪是食品中重要的营养成分之一。
脂肪可为人体提供必需脂肪酸。脂肪是一种富含热能营养素，是人体热能的主要来源。
脂肪是脂溶性维生素的良好溶剂，有助于脂溶性维生素的吸收。
脂肪与蛋白质结合生成脂蛋白，在调节人体生理机能和完成体内生化反应方面都起着重要的作用。
在食品加工过程中，原料、半成品、成品的脂类含量对产品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有直接的影响。蔬菜本身的脂肪含量较底，在生产蔬菜罐头时，添加适量的脂肪可以改善产品的风味，对于食品面包之类焙烤食品，脂肪含量是卵磷脂组分，对于面包心的柔软度、面包的体积及其结构都有影响。
因此，在含脂肪的食品中，其含量都有yi定的规定，是食品质量管理中的一项重要指标。测定食品的脂肪含量，可以用来评价食品的品质，衡量食品的营养价值，而且对实行工艺监督，生产过程的质量管理，研究食品的储藏方式是否恰当等方面都有重要的意义。
（2）食品中脂肪存在形式
食品中脂肪有游离态存在形式的，如动物性脂肪及植物性油脂；也有结合态的，如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及某些加工品（如焙烤食品及麦乳精等）中的脂肪，与蛋白质或碳水化合物形成结合态。
对大多数食品来说，游离态脂肪是主要的，结合态脂肪含量较少。
脂类的共同特点是在水中的溶解度小，能溶于脂肪溶剂中，再根据相似相溶的规律具体选择。
（3）脂类的提取
常用测定脂类的有机溶剂有：
①乙mi
有yi定*性，但不如乙醇、甲醇、水等溶解脂肪的能力强，应用Z多。GB中关于脂肪含量的测定都采用它作提取剂。
乙mi沸点低（34.6℃），易燃。乙mi可饱和2%的水。含水乙mi在萃取脂肪的同时，会抽提出糖分等非脂成分。所以用无水乙mi作提取剂，被测样品也要事先烘干。
②石油醚
石油醚的沸点比乙mi高，不太易燃，溶解脂肪能力比乙mi弱，吸收水分比乙mi少，允许样品含微量的水分。石油醚溶解脂肪的能力比乙mi弱些，但吸收水分比乙mi少，没有乙mi易燃，使用时允许样品含有微量水分，这两种溶液只能直接提取游离的脂肪，对于结合态脂类，预先用酸或碱破坏脂类和非脂成分的结合后才能提取。
因二者各有特点，故常常混合使用。但乙mi、石油醚都只能提取样品中游离态的脂肪。对于结合态的脂类，预先用酸或碱及乙醇破坏脂类与非脂类的结合后，才能提取。
3. 氯仿-甲醇
一种有效的溶剂，对脂蛋白、磷脂提取效率较高。适用于水产品、家禽、蛋制品中脂肪的提取。
样品的预处理
1）固体样品要粉碎，颗粒大小要合适，注意粉碎过程中的温度，防止脂肪氧化。
2）样品要干燥
温度低——酶活力高，脂肪易降解。
温度高——脂肪易氧化成结合态。
较理想的方法是冷冻干燥法。
3）酸水解：对于乙mi不能渗入内部的或含结合态脂肪。
用溶剂提取食品中的脂类时，要根据食品种类、性状及所选取的分析方法，在测定之前对样品进行预处理。有时需将样品粉碎、切碎、碾磨等；有时需将样品烘干；有的样品易结块，可加入4-6倍量的海砂；有的样品含水量较高，可加入适量无水硫酸钠,使样品成粒状。以上的处理目的都是为了增加样品的表面积，减少样品含水量，使有机溶剂更有效的提取出脂类。
2 常用的测定脂类的方法
常用的测定脂肪的方法有：索氏提取法、酸分解法、罗斯-哥特里法、巴布科克氏法、盖勃氏法和氯仿-甲醇提取法等。酸水解法能对包括结合态脂类在内的 全部脂类进行定量。而罗斯-哥特里法主要用于乳及乳制品中脂类的测定。
2.1 索氏提取法
(1) 原理
将经前处理而分散且干燥的样品用无水乙mi或石油醚等溶剂回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，回收溶剂后所得到的残留物，即为脂肪（或粗脂肪）。
一般食品用有机溶剂浸提，挥干有机溶剂后得到的重量主要是游离脂肪，此外，还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂等物质，所以用索氏提取法测得的脂肪，也称粗脂肪。
(2) 适用范围与特点
此法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不易吸湿结块的样品的测定。索氏提取法测得的只是游离态脂肪，而结合态脂肪测不出来。
此法经典，对大多数样品的测定结果比较可靠。但费时长（8-16 h）溶剂用量大，需要专门的仪器,索氏提取器。
(3) 仪器
①索氏提取器
②电热恒温水浴（50~80℃）
③电热恒温烘箱（80~120℃）
(4) 试剂
无水乙mi或石油醚
(5) 测定方法
滤纸筒的制备→样品制备→索氏提取器的准备→抽提→回收溶剂
将滤纸裁成8cm×15cm大小，以直径位 2.0cm 的大试管为模型，将滤纸紧靠试管壁卷成圆筒型，把底端封口，内放一小片脱脂棉，用白细线扎好定型，在100~105℃烘箱中烘至恒量（准确至0.0002g）。
① 滤纸筒的制备
固体样品：精密称取干燥并研细的样品 2～5g（可取测定水分后的样品)，必要时拌以海砂，无损地移入滤纸筒内。
半固体或液体样品：称取 5.0-10.0g 于蒸发皿中，加入海砂约 20g 于沸水浴上蒸干后，再于95-105℃烘干、研细，全部移入滤纸筒内，蒸发皿及粘附有样品的玻璃棒都用沾有乙mi的脱脂棉擦净，将棉花一同放进滤纸筒内。
② 样品处理
索氏抽提取器是由回流冷凝管、提脂管、提脂烧瓶三部分所组成，抽提脂肪之前应将各部分洗涤干净并干燥，提脂烧瓶需烘干并称至恒量。
③索氏抽提取器的准备
将滤纸筒或滤纸包放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙mi或石油醚（30-60℃沸程） ，加量为接受瓶的2／3体积，于水浴上(夏天65℃，冬天80℃左右)加热使乙mi或石油醚不断的回流提取，控制每分钟滴下乙mi80滴左右，抽提3-4h至抽提（视含油量高低，或8-12h，甚至24h）。可用滤纸或毛玻璃检查，由提脂管下口滴下的乙mi滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下痕迹。
④抽提
⑤ 回收溶剂
⑥ 称重
取出滤纸筒，用抽提器回收乙mi，当乙mi在提脂管内将虹吸时立即取下提脂管，将其下口放到盛乙mi的试剂瓶口，使之倾斜，使液面超过虹吸管，乙mi即经虹吸管流入瓶内。按同法继续回收，将乙mi蒸出后，取下提脂烧瓶，于水浴上蒸去残留乙mi。用纱布擦净烧瓶外部，于100~105℃烘箱中烘至恒量并准确称量。或将滤纸筒置于小烧杯内，挥干乙mi，在100 ~105 ℃烘箱中烘至恒量，滤纸筒及样品所减少的质量即为脂肪质量。所用滤纸应事先用乙mi浸泡挥干处理，滤纸筒应预先恒量。
(6) 结果计算
(7) 注意及说明
① 样品应干燥后研细，样品含水分会影响溶剂提取效果，而且溶剂会吸收样品中的水分造成非脂成分溶出。装样品的滤纸筒yi定要严密，不能往外漏样品，也但不要包得太贤影响镕剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。
② 对含多量糖及糊精的样品，要先以冷水使糖及糊精溶解，经过滤除去，将残渣连同滤纸一起烘干，再一起放入抽提管中。
③ 抽提用的乙mi或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。
④提取时水浴温度不可过高，以每分钟从冷凝管滴下80滴左右，每小时回流6-12次为宜，提取过程应注意防火。
⑤在抽提时，冷凝管上端Z好连接一个氯化钙干燥管，这样，可防止空气中水分进入，也可避免乙mi挥发在空气中，如无此装置可塞一团干燥的脱脂棉球。
⑥抽提是否，可凭经验，也可用滤纸或毛玻璃检查，由抽提管下口滴下的乙mi滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下油迹表明已抽提。
⑦在挥发乙mi或石油醚时，切忌用直接火加热，应该用电热套，电水浴等。烘前应驱除全部残余的乙mi，因乙mi稍有残留，放入烘箱时，有发生爆炸的危险。
⑧反复加热会因脂类氧化而增重。重量增加时，以增重前的重量作为恒重。
⑨因为乙mi是麻醉剂，要注意室内通风。
2.2 酸分解法
某些食品中，脂肪被包含在食品组织内部，或与食品成分结合而成结合态脂类，如，谷物等淀粉颗粒中的脂类，面条、焙烤食品等组织中包含的脂类，用索氏提取法不能提取出来。这种情况下，要用强酸将淀粉、蛋白质、纤维素水解，使脂类游离出来，再用有机溶剂提取。
此法使用于各类食品总脂肪的测定，对于易吸潮，结块，难以干燥的食品应用本法测定效果较好，但此法不宜用高糖类食品，因糖类食品遇强酸易炭化而影响测定效果。
应用此法，脂类中的磷脂，在水解条件下将几乎分解为脂肪酸及碱，当用于测定含大量磷脂的食品时，测定值将偏低。故对于含较多磷脂的蛋及其制品，鱼类及其制品，不适宜用此法。
(一）原理
将试祥与盐酸溶液一同加热进行水解，使结合或包藏在组织里的脂肪游离出来，再用乙mi和石油醚提取脂肪，回收溶剂，干燥后称量，提取物的重量即为脂肪含量。
（二） 适用范围与特点
此法适用于各类、各种状态的食品中脂肪测定。加工后的混合食品，易吸湿，不好烘干的，用索氏提取法不行的样品，效果更好。
本法不适于测定含磷脂高的食品、如：鱼、贝、蛋品等。因为在盐酸加热时，磷脂几乎分解为脂肪酸和碱，当只测定前者时，使测定值偏低。本法也不适于测定含糖高的食品，因糖类遇强酸易炭化而影响测定。
(1) 仪器
① 恒温水浴50~80℃
② 100ml 具塞量筒
(2) 试剂
① 乙醇（95%体积分数）
② 乙mi（不含过氧化物）
③ 石油醚（30~600C沸腾）
④ 盐酸
(3) 测定步骤
① 水解：准确称取固体样品2g于50ml大试管中，加入8mL水，用玻璃棒充分混合，加10ml盐酸。或称取液体样品10g于50mL大试管中，加10mL盐酸。混匀后于70~80℃的水浴中，每隔5~10min用玻璃棒搅拌一次至脂肪游离为止，约须40~50min，取出静置，冷却。
② 提取：取出试管加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移入100mL具塞筒中，用25mL乙mi分次冲洗试管，洗液一并倒入具塞量筒内。加塞振摇1min，将塞子慢慢转动放出气体，再塞好，静置15min，小心开塞，用石油醚-乙mi等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置10~20min,待上部液体清晰，吸出上层清夜于已恒量的锥形瓶内，再加入5ml乙mi于具塞量筒内振摇，静置后仍将上层乙mi吸出，放入原锥形瓶内。将锥形瓶于水浴上蒸干，置95~105℃烘箱中干燥2h，取出放干燥器中冷却30min后称量
(4) 结果计算
(5) 说明
①开始加入8mL水是为防止后面加盐酸时干试样固化，水解后加入乙醇可使蛋白质沉淀，降低表面张力，促进脂肪球聚合，同时溶解一些碳水化合物如糖，有机酸等。后面用乙mi提取脂肪时因乙醇可溶于乙mi故需加入石油醚降低乙醇在醚中的溶解度，使乙醇溶解物残留在水层，使分层清晰。
②挥干溶剂后残留物中若有黑色焦油状杂质，是分解物与水一同混入所致，会使测定值增大造成误差，可用等量的乙mi及石油醚溶解后，过滤，再次进行挥干溶剂的操作。
③若无分解液等杂质混入，通常干燥2h即可恒量。
2.3 氯仿-甲醇提取法
索氏提取法对包含在组织內部的脂肪等不能提取出来，酸分解法常使磷脂分接而损失。而在yi定的水分存在下，*性的甲醇及非*性的氯仿混合溶液却能有效地提取结合态脂类，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，此法对于高水分生物试样如鲜鱼、蛋类等脂类的测定更为有效。
(1)原理
氯仿-甲醇提取法的原理是将试样分散于氯仿-甲醇混合液中，于水浴上轻微沸腾，氯仿-甲醇混合液与yi定的水分形成提取脂类的有效溶剂，在使试样组织中结合态脂类游离出来的同时与磷脂等*性脂类的亲合性增大，从而有效地提取出全部脂类。再经过滤，除去非脂成分，然后回收溶剂，对于残留脂类要用石油醚提取，定量。
(2) 仪器
①具塞三角瓶
②电热恒温水浴：50~100℃
③提取装置
④布氏漏斗
⑤具塞离心管
⑥离心机：3000r/min
（3）试剂
①氯仿：97%（体积分数）以上。
②甲醇：96%（体积分数）以上。
③ 氯仿甲醇混合液：按2：1体积比混合。
④ 石油醚。
⑤ 无水硫酸钠：以120~135℃干燥1~2h。
（4）操作步骤
　 ①提取
准确称取均匀样品5g于具塞三角瓶内（高水分食品可加适量硅藻土使其分散），加入60mL氯仿-甲醇混合液（对于干燥食品，可加入2~3mL水）。连接提取装置，于650C水浴中，由轻微沸腾开始，加热1h进行提取。
　 ②回收溶剂
提取结束后，取下烧瓶用布氏漏斗过滤，并用氯仿-甲醇混合液洗涤滤器，烧瓶及滤器中试样残渣，滤液、洗涤液一并收集于具塞三角瓶内，置65~700C水浴中回收溶剂，至烧瓶内物料呈浓稠态，而不能使其干，然后冷却。
③石油醚萃取、定量
用移液管加入25ml石油醚，然后加入15g无水硫酸钠，立即加塞混摇1 min ，将醚层移入具塞离心沉淀管进行离心分离（3000r/min）5min.用10mL移液管加入迅速吸取离心管中澄清的石油醚10mL,于已称量至恒量的干燥称量瓶内，蒸发去除石油醚，于100~105℃烘箱中烘至恒量（约30 min ）。
（5）结果计算
2.4罗斯•哥特里法
此法为国际标准化组织（ISO），联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）等采用，为乳、炼乳、奶粉、奶油等脂类定量的国际标准法。它适用于各种液状乳（生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等）、各种炼乳、奶粉、奶油 及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加工成乳状的食品。
（一）原理
利用氨-乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜使非脂成分溶解于氨-乙醇溶液中，而脂肪游离出来，再用乙mi-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂肪。
（二）适用范围与特点
本法适用于各种液状乳(生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等)，各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中溶解的乳制品，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。
（三）测定方法
取yi定量样品于抽脂 瓶中，分别加入氨水，乙醇，乙mi，石油醚，充分摇匀，待上层液澄清时。读取醚层体积，放出yi定体积醚层于一已值重的烧瓶中，蒸馏回收乙mi和石油醚，烘干至恒重，称重。
2.5 巴布科克法和盖勃法
（一）原理
用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。
（二）适应范围与特点
这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法，适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多的乳品(如甜炼乳、加糖乳粉等)，采用此方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适宜。
此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。
(三)测定方法
精密吸取17.6mL样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶颈缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。置乳脂离心机上，以约1000r/min的速度离心5min，取出，加入80oC以上的水至瓶颈基部，再置离心机中离心2min，取出后再加入80oC以上的水至脂肪浮到2或3刻度处，再置离心机中离心1min，取出后置55~60oC水溶中，5min后立即读取脂肪层Z高与Z低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。
(四) 说明及讨论
① 硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白溶解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。
② 硫酸除可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。
③ 盖勃法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出，并能降低脂肪球的表面张力，以利于形成连续的脂肪层。
④ 加热（65~70oC水浴）和离心的目的是促使脂肪离析。。
⑤ 巴布科克法中采用17.6ml标准吸管取样，实际上注入巴氏瓶中的样品只有17.5ml，牛乳的相对密度为1.03，故样品重量为17.5×1.03=18g。巴氏瓶颈的刻度（0~10%）共10个大格，每大格容积为0.2ml，在60oC左右，脂肪的平均相对密度为0.9，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为0.2×10×0.9=1.8g。18g样品中含有1.8g脂肪，即瓶颈全部刻度表示为脂肪含量10%，每一大格代表1%的脂肪。故瓶颈刻度读数即为样品中脂肪百分含量。
⑥每组样品只取两格乳脂瓶进行测定。放入离心机时，对称放置。
⑦硫酸的浓度和用量严格按照规定，沿瓶壁缓慢加入，回旋摇动，使充分混合 ，否则易时脂肪层产生黑色块粒。
补充： 食用油脂几项理化特性的测定
一、酸价的测定
酸价——中和 1 g 油脂中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量(mg)。
酸价是反映油脂酸败的主要指标。
二、碘价的测定
碘价（碘值）——100 g 油脂所吸收的氯化碘或溴化碘换算成碘的质量(g)。
碘价在yi定范围内反映油脂的不饱和程度。
三、过氧化值的测定
过氧化值——滴定 1g 油脂所需用( 0.002 mol/L ) Na2S2O3 标准溶液的体积(mL)。
过氧化值的大小是反映油脂是否新鲜及酸败的程度。
四、皂化价的测定
皂化价——中和 1 g 油脂中的全部脂肪酸（游离+结合的）所需氢氧化钾的质量(mg)。
皂化价可对油脂的种类和纯度进行鉴定。
五、羰基价的测定
用羰基价来评价油脂中氧化物的含量和酸败程度。
总羰基价—— 用比色法测定。
思考题
1、脂类测定提取剂的种类、优缺点。
2、索氏提取法的原理、方法、注意事项。
3、乳脂肪的测定方法有哪几种？
4、食用油特性（酸价、碘价、氧化值、过氧化值、皂化价、羰基价）的定义。