饮用水中铜绿假单胞菌的污染、控制及检验

1.水样过滤

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器,将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤,然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。

2.培养

将平板倒置于36℃士1℃培养20 h~48 h,并防止干燥。

3.结果观察

在培养20 h~24 h和40 h~48 h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数。

计数所有显蓝色或绿色(绿脓色素)疑似铜绿假单胞菌的菌落，并进行绿脓菌素确证性试验。

在紫外线下检查滤膜时,应避免长时间在紫外光下照射,否则可能会将平板上的菌落杀灭,而导致无法在证实培养基上生长。计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落,并进行乙酰胺肉汤确证性试验。

将其他所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、42℃生长、乙酰胺液体培养基、金氏B培养基确证性试验,培养20 h~24 h观察结果,防止因为培养40 h~48 h导致菌落过分生长而出现菌落融合。

在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤见表30。

1、若CN板上是蓝绿色（如下图）疑似铜绿假单胞菌的菌落,需进行绿脓菌素确证性试验

绿脓菌素试验：将在CN琼脂上呈蓝色或绿色菌落的纯培养物分别接种在绿脓菌素测定培养基上,置36℃±1℃培养24h±2h,加入三氯甲烷3mL~5mL,可捣碎培养基并充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烧,待三氯甲烷提取液呈蓝色时,用吸管将三氯甲烷移到另一试管中,并加入1 mol/L的盐酸1 ml,振荡后﹐静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在。

1.1绿脓菌素测定培养基中加入三氯甲烷后的颜色（如下图）

1.2用吸管将三氯甲烷移到另一试管内加入盐酸，振荡，静置（如下图）

1.3蓝色菌落呈粉红色，绿色菌落呈淡粉色，有绿脓菌素存在。

2、若CN板上有荧光（如下图）

按照GB8538-2022标准，

将在CN琼脂上发荧光,非蓝色且非绿色菌落,或不发荧光、红褐色菌落纯培养物接种到乙酰胺液体培养基中,在36 ℃士1 ℃下培养20 h~24 h。然后向每支试管培养物加入Ⅰ滴~2滴钠氏试剂,10 s内检查各试管的颜色变化,如表现出从黄色到砖红色的颜色变化,则为阳性结果,否则为阴性。

3、若CN板上是红褐色

按照GB8538-2022标准，红褐色菌落要进行产氨试验、氧化酶试验、42℃生长试验、金氏B产荧光试验。

鉴于本人经验有限，接触样品不多，买的标准菌株也是绿色形态（前面那株蓝色菌落也是样品中发现的，甚是宝贵）。所以，至今未见过红褐色菌落，若有同行有检出或者见过，还望交流，多加学习。

3.1标准菌株形态（如下图）

3.2产氨实验（同上，略）

3.3氧化酶试验（如下图）

取2滴~3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂/铉,玻璃或其他适宜材质的接种环(棒),将适量的CN琼脂上不发荧光,红褐色菌落的纯培养物涂布在预备好的滤纸上。在10 s内显深蓝紫色的视为阳性反应。

3.4金氏B产荧光试验（如下图）

将在CN琼脂上不发荧光、红褐色且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于36℃士l℃恒温箱培养ld~5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光,将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。

3.5 42℃生长试验

将在CN琼脂上发荧光、非蓝色且非绿色菌落的纯培养物接种营养琼脂平板上，42℃士1℃培养24 h~-48 h,能生长的为阳性结果﹐否则为阴性。

                   阳性                      阴性

4、其他

其他非前面三种，则判断不是铜绿假单胞菌。

二、饮用水中铜绿假单胞菌快速监测解决方案#微生物快速检测系统Soleris#

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