高通量384孔实时荧光定量PCR仪

HRM实现基因分型 作者：福生生物 基因分型在动物、植物、微生物的物种、菌种筛查、筛选、缺陷、突变基因的检测，根据个体基因类型实现对诸如癌症治疗、监测等的精准用药，以及消费类基因检测如酒精代谢能力基因检测等等领域有很多应用。 通常，基因分型SNP采用荧光探针终点法，检测一个位点需要两个荧光探针，如一个探针的荧光报告基团用FAM通道，另一个用HEX(VIC)通道来检测。由于合成PCR荧光探针的成本较高，为降低成本，可以采用较小的反应体系，如在384孔荧光定量PCR仪上使用5uL的反应体系。对于一些非临床及消费类、或者需要检测几十个位点以上、对成本敏感的基因分型检测应用项目，可以考虑使用饱和染料的高分辨熔解曲线法HRM（High Resolution Melting Curve分辨率优于0.1°C），如果不包括核酸提取的费用，与探针法比，成本可降低10倍，甚至100倍。 HRM法为了能够在熔化温度Tm上区分出只差一个碱基的两个DNA片段，在保证特异性的前提下，选择被扩增的DNA片段的长度越短越好，因此，除了引物的设计有扩增片段短的特殊要求外，对荧光定量PCR仪的HRM性能及扩增的准确性能则有很高的要求。以下几点是保证HRM实现正确、可靠的基因分型的关键。 首先，HRM的分辨率最好优于0.05°C，一般，只有采用荧光成像技术的QPCR仪，因为同时采集所有样品孔的信号才能胜任，而采用扫描技术的仪器完成一次全板扫描一般需要5秒以上，也就是说第一个孔和最后一个孔的检测时间差为5秒以上，熔化过程中温度是连续变化的，这将导致每次检测各孔上的温度的不一致，因此，扫描式的QPCR仪一般不适合做HRM。 第二，为了用只生成小于100bp扩增产物的引物，有时可能无法很好地兼顾特异性，又由于HRM染料法本身特异性就较弱，这就给荧光定量PCR实验带来易发生非特异性的压力，除了需要选用扩增特异性好的QPCR Master Mix外，还需要先用梯度QPCR预实验来优化退火温度，找到该引物的最佳退火温度后，再使用Touchdown PCR 或称TD PCR来有效地控制非特异性扩增。Stepdown PCR也能够抑制非特异性扩增，但抑制效果较Touchdown PCR弱一些。 第三， 如果需要区分两个纯合子的Tm差较小时，例如当两个纯合子的Tm差只有0.5°C时，它们对应的杂合子就可能难以单纯依靠Tm与两个纯合子区分开来，这时，我们可以引入熔解曲线的Tm峰宽因子或峰的线型来判断杂合子。   图一为在福生生物的FS384 QPCR仪上使用5uL反应体系的FAM和VIC两种探针的终点法检测一个位点的384个样品的SNP分型结果。   图二为在福生生物的FS384 QPCR仪上用Touchdown PCR方法来扩增，接着用高分辨率0.02°C 的HRM实现低成本的基因分型，图中左下角的表列出了所有样品孔，根据Tm值及其峰宽值正确判断出每个样品的分型结果。在这个实验中，两个纯合子的峰宽都小于1.5°C，而杂合子的峰宽在2°C左右。