BLT小课堂|水母发光蛋白检测法在细胞钙离子含量测定中的应用

广州博鹭腾

2021/12/27 17:23

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Ca²⁺作为普遍的第二信使在细胞信号转导过程中起着非常重要的作用，是单个细胞生存和死亡的信号。它参与了神经传导、血液凝固、肌肉收缩、心脏收缩、大脑功能、酶功能以及内分泌腺的激素分泌等各种生理机能。而人们对Ca²⁺在信号转导中作用的认识，则很大程度上取决于Ca²⁺测定技术。

目前常用的Ca²⁺检测方法主要有：Ca²⁺选择性微电极测定法、同位素示踪法、核磁共振法和水母发光蛋白检测法等。

Ca²⁺选择性微电极测定法:Ca²⁺选择性微电极一种电化学敏感器。利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是Ca²⁺对数的线性函数，遵循Nernst方程。

优点：直接、敏感地测定组织或细胞内的Ca²⁺，不需使用指示剂，不影响结合钙和游离钙的平衡。
缺点：反应速度慢而无法测定Ca²⁺的快速变化，而且穿刺损伤细胞可引起渗漏，且不适用于太小的细胞。

同位素示踪法：用放射性核素⁴⁵Ca²⁺对Ca²⁺进行示踪，可测量出通过细胞膜转运到细胞内Ca²⁺增加的速度及浓度的大小，揭示Ca²⁺泵的作用，目前主要用于测定跨膜Ca²⁺的流动。

优点：测量方法简单易行，比普通化学分析法的灵敏度高。确定放射性示踪剂在组织器官内的定量分布，可以达到细胞、亚细胞乃至分子水平。

缺点：静态效果差，需要特定的同位素测定仪，并且要注意示踪剂的同位素效应和放射效应问题。

核磁共振法：是一种新的、非光学技术的Ca²⁺检测方法。由于正常生物体内氟含量很少，为了得到足够的响应，在检测时需要使用含氟指示剂。该指示剂经过化学修饰后进入细胞，进而被水解成游离状态，然后与Ca²⁺结合，根据获得的波谱图计算出Ca²⁺的浓度。

优点：具有非破坏性和无损伤性，能够在接近生物样本生理状态下连续动态地进行检测，准确反应Ca²⁺浓度。

缺点：需要核磁共振仪，成本较高。

荧光探针法：目前常用的Ca²⁺荧光探针有Fluo-3、Fluo-4、Fluo-８等。这类探针本身无法进入细胞，但它的亲脂性衍生物却可以透过细胞膜进入细胞。一旦进入细胞，这类亲脂性衍生物的亲脂性封闭基团在细胞非特异性酯酶的作用下被分裂除去，在细胞内便会形成一种带负电荷的荧光染料。与胞内Ca²⁺结合时，其荧光强度显著增加。

优点：指示剂易导入细胞，空间分辨率高，反应速度快，而且可同时检测多重离子。
缺点：需要有荧光显微镜或激光共聚焦显微镜，成本较高。

水母发光蛋白检测法:

最近十几年来，水母发光蛋白(Aequorin)很受人们的关注。水母发光蛋白由189个氨基酸组成，具有3个Ca²⁺结合的EFhand结构，所以水母发光蛋白可作为检测Ca²⁺的新型探针。

优点：Ca²⁺/水母蛋白复合物能检测~0.1μm到＞100μm范围内的钙离子浓度，且复合物不会从细胞内泄露出来，可检测几小时至数十天内Ca²⁺浓度的变化。比荧光探针法的背景低，样本本身不会发生自荧光。

腔肠素的性质

腔肠素(Coelenterazine)作为海洋动物体内贮存光能的分子，它广泛存在于海洋生物体内，比如海肾、海蜇、水螅等。腔肠素是天然荧光素中最普遍的，它可作为很多荧光素酶的底物。目前研究得最透彻的以腔肠素为底物的荧光素酶来源于海肾（Renilla），即海肾荧光素酶（Renilla reniformis，简称Rluc）。

腔肠素的工作原理

腔肠荧光素是一个分子量约400 Da 的疏水基团，它可以自由穿越细胞膜。在一个以荧光素/荧光素酶为基础的系统中，腔肠素作为以水母发光蛋白为代表的海洋发光蛋白的辅助因子，与水母发光蛋白进行稳定的结合，引起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键破裂，腔肠荧光素(Coelenterazine)被氧化脱羧，形成腔肠酰胺（Coelenteramide），释放出CO₂，同时发出波长为469nm的蓝色生物荧光，该荧光可用博鹭腾高灵敏度管式/板式发光检测仪进行测定。

图1.腔肠素/水母发光蛋白检测Ca²⁺机制

水母发光蛋白一旦和Ca²⁺反应即丧失发光功能，因此当一部分水母发光蛋白与Ca²⁺反应时，被消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出Ca²⁺浓度变化，而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与Ca²⁺浓度之间存在线形关系。

如同萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的活性也不需要翻译后修饰，一旦翻译完成即可行使遗传报告基因的功能。但是与萤火虫荧光素酶又有差异，即腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更利于生物荧光的研究。

技术小结

由于Ca²⁺在生命活动的各种生理生化反应、疾病的发生和发展中都扮演着极其重要的角色，而游离的Ca²⁺浓度变化又与细胞的功能、信号转导乃至细胞的凋亡有密不可分的联系，因此，研究如何检测细胞内游离Ca²⁺浓度显得尤为重要。

Ca²⁺选择性微电极测定法不需要使用指示剂，但是穿刺过程会损伤细胞，进而引起渗漏。同位素示踪法简单，但是静态效果差，还需要注意同位素效应和放射效应问题。核磁共振法和荧光探针法都需要特定的仪器，成本较高。水母发光蛋白检测法不需要激发光源，因而消除了细胞自发荧光的干扰，背景荧光远低于使用钙离子指示剂的荧光。另外腔肠素具有疏水性，易于通过细胞膜，适于全细胞的研究。腔肠素/水母发光蛋白的生物荧光反应对Ca²⁺浓度的变化非常敏感，但是这种发光相对较弱，因此需要使用高灵敏度的发光检测仪进行检测。

图2.Lux-T020高灵敏度管式发光检测仪

图3.Lux-P110高灵敏度板式发光检测仪

博鹭腾公司的管式/板式发光检测仪采用超高灵敏度的低噪音单光子PMT，同时通过计数电子记录和分化脉冲的单脉冲输出的能力来定义高数量级，从而实现更宽的动力学范围。高灵敏度板式发光检测仪设计了2个独立的喷射式自动进样器，精度高于97%。两款产品都适用于以水母发光蛋白为载体的 Ca²⁺ 浓度测定，极其微小的浓度变化也可以轻松检测。

除了检测上述Ca²⁺ 浓度以外，博鹭腾高灵敏度管式/板式发光检测仪还可以测定活细胞内报告基因、ATP、活性氧、半胱天冬酶等指标。