rapidFLIM高速荧光寿命成像技术(FLIM)

重新定义动态荧光寿命成像标准的快速成像技术

简介：

利用rapidflim荧光寿命成像技术，可以有效地对样品的多种动态过程进行荧光寿命成像。该技术支持下的flim采集过程非常迅捷，可达到每秒几帧的速度，适用于记录样品的动态过程（例如蛋白质相互作用，化学反应和离子流动），以及针对流动性高的样品的进行成像（流动性高的细胞器或颗粒，细胞的迁移等），同时还可以用于研究荧光共振能量转移的动态特性。

系统组成：

picoquant提供光扫描显微镜(lsm)的高速荧光寿命成像功能升级包

激光扫描显微镜升级包

共聚焦激光扫描显微镜目前被广泛应用于细胞与分子生物学，生化学及其它相关科研领域。picoquant所提供的lsm升级包，通过将现有显微系统与时间分辨技术相集成，极大地拓展了原有系统的功能：包括荧光寿命成像(flim)、荧光相关光谱(fcs)、以及其它与时间分辨相关的技术应用。对于高速荧光成像功能，在对显微镜系统进行升级时，必须使用timeharp 260 nano dual时间相关单光子计数模块，以及pma hybrid系列超短死区时间的探测器。此外，所使用的计算机硬件系统必须具备高速读写的固态硬盘。

应用：

• rapidflim高速荧光寿命成像可被用于以下的应用领域：

• 动态寿命过程追踪(例如，相互作用状态的改变，化学反应，高流动性样品研究)

• 多种因素(例如环境中的离子浓度，ph值，氧浓度等)影响下的荧光寿命快速改变

• 通过荧光共振能量转移来探测分子的瞬态相互作用(例如细胞之间)

• 通过荧光共振能量转移监测流动结构中的分子相互作用(例如研究细胞器的流动性，囊泡运输，粒子运动及细胞迁移的机理)

• 活细胞的快速荧光寿命成像，包括z-stacks深层成像，时间序列，组织的自发荧光和细胞代谢的动态特性

• 利用组织的特定自发荧光特性研究细胞代谢过程

• 高量级flim筛查

高量级的探测速率(30~40 m计数/秒)意味着样品需要有较高的发光强度等级。内因性表达等级较低的荧光蛋白通常不足以用以高速荧光寿命成像。目前看来，gfp染料蛋白由于其寿命随激发光的强弱而产生变化，也不适用于高速荧光寿命成像。

新型的染料大多具有高亮度，高稳定性，可被用于活体等特性，例如venus荧光蛋白，用于位点专一蛋白修饰的snap-，halo-及tub-tag有机染料标记技术，及活体sted染料(例如spirochrome公司研发的silicone rhodamine)。这些染料极好的弥补了传统荧光蛋白(例如gfp)的缺陷和不足，适用于全新的高速荧光寿命成像技术。

案例：

珠扩散动态学

视频所示的两种经染料标记的磁珠，通过高速荧光寿命成像进行监测。较大的磁珠直径为3.42微米，使用nile red染料进行标记，荧光寿命为3.3纳秒。较小磁珠的平均直径为2.07微米，通过寿命为4.0纳秒的dragon green染料进行标记。两种样品的荧光寿命差值约为700皮秒。磁珠在水滴的边缘形成一种随机的结构，随后被紧邻的水滴所打乱。最后，在扩散过程中，重聚成与最初随机结构相似的结构。该影像的采集速率为3帧/秒，8微秒/像素的驻留时间。单个像素的最大光子采集量为300/帧。

• 样品参数：

• 寿命3.3纳秒，磁珠直径3.42微米

• 寿命4.0纳秒，平均磁珠直径2.07微米

• 实验配置：

• 基于fv1000的lsm升级包

• 激发光源：485 nm, 20 mhz

• 时间相关单光子模块：time harp 260 nano

• 探测器：pma hybrid, > 500 nm

• 图像分辨率：128 ×128像素

• 扫描速度：8 μs / px ~ 3 fps

• 最大300光子/像素

• 数据分析：symphotime 64