【NEPA21 应用科普】Cre重组酶蛋白电转染进入完整烟草细胞

位点特异性DNA重组酶使研究人员能够在广泛的细胞类型和生物体中操纵各种基因。特别是Cre/lox重组系统已成为基因功能分析的有力技术。重组反应可导致染色体DNA缺失、倒位、插入或易位。此外，Cre/lox系统的分子工程使我们能够使用重组酶与不同于原始对的识别序列的多重或正交组合来实现高度先进的基因组工程，例如用于去除HIV的Tre- loxltr或用于神经元成像的Brainbow技术。尽管该重组系统的重要性不言而喻，但Cre/lox系统的有效性在很大程度上取决于将Cre重组酶蛋白递送到细胞中的方法的可用性。

在植物中，基于DNA的递送法（如农杆菌介导基因递送法）具有毒性强、递送弱等局限性，为了克服这些因素，基于蛋白质的递送引起了较大的关注。近日，日本科学家在国际知名科学期刊Plants上发表了题为“A Method for Electroporation of Cre Recombinase Protein into Intact Nicotiana tabacum Cells”论文，目的是为了评估将蛋白质电转染到烟草细胞BY-2细胞的方法可行性，结果实现了将蛋白质电转染法扩展到除拟南芥的其他植物细胞（烟草细胞）的可行性。

作者先建立了一个报告细胞系BY-2-xGxFL，以评估Cre蛋白进入细胞诱导基因组DNA重组的效率，报告细胞系含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因盒以及转录终止信号和编码荧光素酶(FLuc)的序列。为了验证对比农杆菌介导法（AMGT）与电转染法的效果，将BY-2细胞与含有pCambiaN-xGxFL（携带荧光素酶报告盒）的农杆菌细胞在100µM乙酰丁香酮的存在下混合进行感染，同时，使用NEPA21电转染仪(NEPA GENE)将烟草细胞BY-2细胞悬浮在含有Cre蛋白的200µL Opti-MEM 溶液中。结果发现AMGT法不表达FLuc，而电转染法递送的Cre蛋白诱导了位于GFP上下行的两个loxP位点的重组，BY-2-xGxFL细胞开始表达FLuc，从而发光。该项研究中，作者还优化了电转条件发现在在50 V/cm的场强和20 ms的脉冲时长下获得了最佳转染条件(图1b)。此条件下，经蛋白质电转染处理的报告细胞表现出较小的细胞毒性和最强的发光。接下来，作者还评估了Cre蛋白浓度对电转染效率的影响，采用最佳电转染程序，用0.01-5µM的Cre蛋白对细胞分别进行电转染。结果显示，Cre蛋白的递送会随着Cre蛋白浓度的增加而增强发光(图1c)。在电转染后3-8天内，且较高浓度的Cre蛋白对细胞毒性影响不大(图1d)。这些结果表明，蛋白质浓度是影响蛋白质电转染进入细胞效果的重要因素。

为了进一步验证Cre蛋白的传递，作者分析了有或没有蛋白电转染的报告细胞系的基因组DNA。如图1e所示，电转染细胞在PCR产物上呈现出显著的比例，说明在最佳条件下电转染将Cre蛋白传递到细胞中，并诱导了目标DNA序列的重组。

蛋白质的种类、特性、浓度、电转染条件以及靶细胞的类型都会极大地影响递送效率，与DNA的递送不同，将蛋白质递送到细胞壁完整的植物细胞会带来很多好处，特别是无基因组修饰或编辑技术有望在植物工程中发挥重要作用。本研究中，采用NEPA21电转染仪成功将Cre蛋白导入烟草细胞，并通过基因组重组事件观察了其活性，使得烟草细胞BY-2在药物、生物制药的生产以及直接递送蛋白质的生物工程中发挥更大的价值。

NEPA21高效基因转染系统采用全新设计的电转程序，配合专利的电压衰减设计，在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。操作简单，电转参数可见可调，适用性强。

特别适用于难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵及宫内胚胎等的转染，多篇文献支持！

文章出处：

论文链接：

https:// doi.org/10.3390/plants12081631

参考文献：

1、Furuhata Y, Egi E, Murakami T, Kato Y. A Method for Electroporation of Cre Recombinase Protein into Intact Nicotiana tabacum Cells. Plants. 2023; 12(8):1631.

2、Furuhata, Y.; Sakai, A.; Kato, Y. Protein electroporation of Cre recombinase into cultured Arabidopsis cells with an intact cell wall. Protoc. Exch. 2019, 1–9.

3、Furuhata, Y.; Sakai, A.; Murakami, T.; Morikawa, M.; Nakamura, C.; Yoshizumi, T.; Fujikura, U.; Nishida, K.; Kato, Y. A method using electroporation for the protein delivery of Cre recombinase into cultured Arabidopsis cells with an intact cell wall. Sci. Rep. 2019, 9, 2163.

4、Cedeño, C.; Pauwels, K.; Tompa, P. Protein delivery into plant cells: Toward in vivo structural biology. Front. Plant Sci. 2017, 8, 519.

5、Ankrum, J.A.; Dastidar, R.G.; Ong, J.F.; Levy, O.; Karp, J.M. Performance-enhanced mesenchymal stem cells via intracellular delivery of steroids. Sci. Rep. 2014, 4, 203–209.