【NEPA21】利用黄热病病毒复制子构建SARS-CoV-2 repRNA疫苗及其检测

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒病(COVID-19)大流行是一种全球性威胁。SARS-CoV-2的主要传播途径包括咳嗽、打喷嚏和呼吸道飞沫以及气溶胶等。症状轻的患者可在10天后康复，而严重者因肺泡损伤而出现间歇性呼吸衰竭导致死亡，因此为了预防大流行，开发安全有效的疫苗是极有必要的。

2022年，日本科学家在国际知名科学期刊PLOS ONE上发表了题为“Construction and evaluation of a selfreplicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon”的文章，该研究将编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的基因插入到黄热病病(YFV)毒株复制子中，构建并检测了一种repRNA疫苗，复制子RNA (repRNA)是一种安全、有效的疫苗，该疫苗不仅编码抗原基因，还编码RNA复制所需的基因并且自我复制，因此可以引起强大的免疫力。

在本研究中，作者在YFV复制子中构建了含有SARS-CoV-2 （S）蛋白编码区的repRNA疫苗（图1A），同时也构建了non-repRNA疫苗（图1B）。

采用NEPA21电穿孔器(Nepa Gene)将repRNA和non-repRNA疫苗电穿孔至幼鼠肾细胞(BHK)。转染后48 小时，通过western blotting法证实S蛋白在BHK细胞中的表达，同时免疫荧光法证实S蛋白与YFV蛋白共表达。作者采用了Real-time RT-PCR验证repRNA疫苗在BHK细胞中的自我复制能力。然后对6周龄雌性C57BL/6小鼠分别于第0、28、56天经腹腔注射repRNA疫苗、non-repRNA疫苗各1μg，同时利用NEPA21电穿孔器向小鼠大腿处提供电脉冲，增强RNA疫苗的递送。然后通过ELISA法检测了sars - cov - 2s的igg抗体以及YFV非结构蛋白1 (NS1)抗体水平。此外，作者制备了S蛋白假型荧光素酶报告慢病毒作为评价小鼠体液免疫的工具，为了验证YFV复制子骨干系统和体内RNA电穿孔免疫的充分性，构建了DENV含有包膜(E)基因的YFV复制子，并采用与SARS-CoV-2 repRNA疫苗基本相同的方法进行了评估。第三次接种后20天，从小鼠身上分离脾脏淋巴细胞。利用这些脾细胞，采用单色酶联免疫吸附斑点法(IMMUNOSPOT)进行酶联免疫吸附斑点(ELISpot)检测。

通过上述一系列实验，成功生成了一种编码repRNA疫苗的DNA质粒，该质粒在YFV复制子中含有S蛋白的外结构域（图1A）。western blotting法证实了repRNA和non-repRNA在细胞内表达S蛋白(图2A)，但repRNA表达的S蛋白明显高于non-repRNA, non-repRNA几乎检测不到S蛋白(图2B)。此外，利用实时RT-PCR检测转染细胞中RNA水平的动力学，以探究repRNA疫苗的自我复制能力。在转染后24-96小时，与未转染repRNA疫苗的细胞相比，转染repRNA疫苗的细胞中RNA水平显著升高(图2D)。这些数据表明，repRNA疫苗构建成功且具有自我复制能力，证明了其疫苗效力。

图1、repRNA与non-repRNA疫苗的构建

图2、repRNA和non-repRNA疫苗的体外检测

为了进一步研究细胞免疫的诱导作用，在第三次免疫后20天采集接种SARS-CoV-2小鼠的脾细胞，并进行ELISpot检测。在实验模型中，repRNA疫苗的免疫水平虽然有限，但与non-repRNA疫苗相比，它在小鼠体内诱导了t细胞应答(图3)。

图3、repRNA和non-repRNA疫苗的体内检测

本实验中，研究人员借助NEPA21电转染仪卓越的基因导入功能完成了RNA疫苗导入到小鼠的肾细胞中，以及对小鼠进行腿部肌肉电转提高RNA疫苗的转染效果，为实验成功锦上添花。该研究证实所制备的repRNA疫苗能够在体外表达S蛋白并具有自我复制能力。该疫苗在小鼠体内并没有强有力地诱导体液免疫，可能是由于S蛋白表达较低，尽管如此，还是有对S蛋白产生特异性t细胞反应的倾向。同时在诱导t细胞活化程度方面，repRNA疫苗显著高于non-repRNA疫苗，证实了repRNA作为疫苗的有效性。然而，为了提高repRNA疫苗的免疫诱导能力，后续还需要进一步优化疫苗给药方式，提高S蛋白的表达。

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